Мария Сотскова, Виталий Кавтарадзе, «Популярная механика» № 1-2015
Опубликовано на сайте «Элементы»
Гомункул – существо из пробирки, искусственный человек, мечта и несбыточная цель средневековых алхимиков. Но если ученые прошлого имели скорее эгоистичные цели – стать ближе к Творцу и познать некую «истину» жизни, сейчас подход более чем гуманистический.
Вы когда-нибудь задумывались о технологии производства фармацевтических препаратов? От разработки до внедрения лекарства проходят долгий путь – от химической формулы до успешного маркетингового проекта. Но самый сложный и этически спорный момент – это тестирование на животных и дальнейшие испытания на людях. Для тестов обычно используют мышей, ибо их геном весьма близок к человеческому, но все же некоторые специфические реакции проследить не удается.
Существует более 200 факторов совместимости групп крови, примерно столько же веществ-мишеней для лекарств, отвечающих за иммунитет, и множество других уникальных особенностей. Что же случится, если производитель не сможет учесть хотя бы один фактор, не говоря уже об индивидуальных чертах организма? Подобные невольные ошибки приводят к множеству потерянных жизней (за десять лет погибло 1000 испытателей) и к огромным финансовым затратам фармацевтических компаний на вывод препарата из производства, а также судебные иски и восстановление репутации. Разумеется, все эти затраты ложатся на плечи потребителей.
В качестве альтернативы испытаниям на животных в последние годы стала активно применяться технология тестирования на отдельных клеточных культурах. Однако, хотя эта методика снимает этическую проблему, она не дает системного подхода к исследованиям. Ведь препарат, призванный, например, лечить печень, может пагубно сказываться на желудке и почках или даже вызывать смертельно опасную реакцию иммунной системы. Выход из патовой ситуации ученые ищут на стыке биологии и высоких технологий.
Дорога в Россию
«Популярная механика» побывала в лаборатории московского научно-технического центра «БиоКлиникум», где с 2008 года ведется уникальный проект создания «искусственного человека» Homunculus под руководством члена-корреспондента РАН Александра Тоневицкого. Идея проста и от этого еще более гениальна: разместить на пластине площадью с кредитную карточку клетки человека и объединить их системой «сосудов» в подобие живого организма.
Золотая середина. По доступности и релевантности результатов исследования с помощью Homunculus представляются оптимальным компромиссом между испытаниями на людях и тестами на 3D-культурах и животных. Хотя, разумеется, испытания на биореакторе не призваны полностью заменить другие виды тестов.
Идея такого биореактора зародилась сравнительно недавно: в 2007 году появились первые работы немецких ученых во главе с Уве Марксом, в которых высказана идея расположить рядом клетки нескольких типов, чтобы смоделировать их взаимодействие. С тех пор множество лабораторий по всему миру начали по-своему решать эту проблему, однако большинству специалистов удалось создать лишь узкоспециализированные системы. В лаборатории Кае Сато с факультета прикладной биохимии Токийского университета (Япония) изучается взаимодействие раковых клеток опухолей с другими тканями, Дональд Имбер (Институт Вайса, США) создает филигранную модель «легкого на чипе», способную к сокращениям и естественному газообмену.
Идея создания отдельных макетов быстро перерастает в концепцию полноценной живой модели человека, и Уве Маркс с командой ученых из лаборатории TissUse обращается к своему бывшему научному руководителю Александру Тоневицкому, руководителю НТЦ «БиоКлиникум». Так началась история российского проекта «Человек на чипе», который на данный момент располагает единственными в мире рабочими образцами системы.
В лаборатории есть всё необходимое как для прототипирования,
так и для полноценной сборки всех механических и электронных компонентов системы
Технология объединяет в себе достижения самых разных наук, в НТЦ работают микробиологи, химики, физики, программисты и инженеры. «Здесь у нас есть все необходимое: стерильные ПЦР-боксы, печь с плазмой низкого давления, мастерская, оснащенная новейшими инструментами, в том числе 3D-принтером, лазерным гравером и станками с компьютерным управлением», – не без гордости рассказывает наш гид Дмитрий Сахаров, директор проекта Homunculus. В таких условиях группа талантливых молодых ученых создает будущее медицины – маленьких «человечков» на стекле и пластике, которые призваны спасать множество жизней.
Плоть и кровь
Платформа Homunculus состоит из клеточного чипа и блока управления, который отслеживает ход эксперимента и поддерживает жизнь маленького человечка. На чипе размещаются культуры клеток, в первую очередь те, через которые тестируемое вещество будет попадать в организм, а также те, на которые оно должно воздействовать.
СЭНДВИЧ С ТЕХНОЛОГИЯМИ
Дизайн подложки ПДМС последнего поколения
С точки зрения конструкции чип Homunculus выглядит простым, но эта простота кажущаяся. Почти каждый его компонент изготавливается с помощью самых современных технологий, таких как литье под давлением и активация плазмой.
1. В зависимости от задач ячейки могут содержать клетки почки, сердца, мозга, кожи, легких, или в них могут быть установлены оптические или электрохимические сенсоры. 2. Клетки кишечника. 3. Клетки печени. 4. Расширительная камера. 5. Канал для обогащения углекислым газом. 6. Клапаны микронасоса и клапаны резервуаров смены среды
«Кровь» искусственного человека – питательный раствор, снабжающий клетки всеми необходимыми для жизни соединениями. Через него же вводят тестируемое вещество. Раствор содержит набор солей, поддерживающих постоянную кислотность среды, поскольку клетки выделяют в раствор свои щелочные метаболиты. Также в нем содержится питательный бульон, причем «рацион» четко соблюден – присутствует необходимое количество белков, жиров и доступных сахаров. Состав раствора очень близок к составу плазмы крови, а вот аналогов эритроцитов с гемоглобином там нет – кислород поступает в систему растворенным в жидкости.
Клеточные культуры располагаются в трансвелах – специальных ячейках с полупроницаемой мембраной снизу, сквозь которую клетки обмениваются веществами с питательной средой и друг с другом. Возможно, когда-нибудь ученые смогут разместить на платформе и привести во взаимодействие все (или почти все) виды клеток, содержащихся в человеческом организме. Однако, пока количество клеточных ячеек на чипе не превышает шести, разработчики стремятся сосредоточиться на органах, которые непосредственно соприкасаются с тестируемым лекарством, участвуют в его передаче и выделении.
К примеру, если речь идет о таблетках, действующее вещество помещается в ячейку с клетками кишечника, всасывается ими и через мембрану попадает в питательную среду. Наружные средства вводятся через клетки кожи, а внутривенные – непосредственно в раствор. Непременно тестируются печень и почки, участвующие в метаболизме и выведении препарата. Вниманием не обделены сердце и мозг, особенно чувствительные к токсичным препаратам. Перечень доступных клеток можно расширять постоянно – главное, что в рамках теста клеточные культуры функционируют и взаимодействуют максимально правдоподобным образом.
Тест длится около 28 дней, после чего специалисты приступают к обработке результатов. Самый явный показатель – количество живых клеток к концу эксперимента, но наиболее точные результаты дают микробиологические и генетические исследования РНК и ДНК. Это позволяет определить отсроченную токсичность препарата в том случае, когда он не убивает клетку мгновенно, но вызывает мутации в геноме и нарушения метаболизма. Последствия такого отравления могут быть заметны только спустя несколько лет, и стандартные методы лабораторных испытаний не дают их зафиксировать.
К моменту начала работы особо важным для исследователей был вопрос, какие клетки использовать для культивирования? Эмбриональные? Клетки живых людей? Или что-то иное? Ответ был найден неожиданный – ученые используют раковые линии клеток, полученные из мировых клеточных банков. При чем тут онкология? Раковые клетки дольше живут, лучше растут, а самое главное, они стандартны, широко доступны и детально описаны в многочисленных публикациях, при этом их функции точно такие же, как у здоровых.
Эволюция киборга
Несмотря на кажущуюся завершенность и самостоятельность, миниатюрный человечек не может сам дышать или гонять по своим «венам» питательную жидкость. Для этого необходим блок управления – электронный мозг, сердце и легкие «гомункула». Прибор содержит микронасосы, обеспечивающие циркуляцию питательной среды, и вакуумное управление клапанами, установленными в силиконовой прослойке чипа. Кроме того, он подает в систему углекислый газ и кислород, а также поддерживает постоянную температуру чипа.
Блок управления. Внешний блок управления – это сердце, легкие и вегетативная нервная система «гомункула». Он подает в чип кислород и углекислый газ, следит за его температурой и сообщает исследователям о любых изменениях в параметрах чипа, где бы они ни находились в этот момент. Компактный прибор занимает места не больше, чем системный блок настольного компьютера, и имеет дружелюбный интерфейс, с которым могут работать не только сотрудники «БиоКлиникума», но и любые другие специалисты.
Все параметры могут регулироваться в соответствии с задачами эксперимента. Прибор имеет встроенный сенсорный дисплей и подключается к компьютеру по USB или LAN, а интерфейс программного обеспечения сделан так, чтобы врачи и исследователи из других лабораторий могли легко и быстро овладеть всеми функциями. В общем, это не прибор, созданный для конкретной задачи, а многофункциональная платформа, готовая к выпуску на рынок.
Блок управления, как и чип, – детище центра. «Все используемые компоненты давно известны инженерам во всем мире, но их правильное совмещение и калибровка делают разработку уникальной и инновационной», – говорит Дмитрий Сахаров. Вначале все детали прибора изготавливали вручную, включая печать плат и сборку корпусов, но, когда начались продажи, основные компоненты стали заказывать сборочному предприятию в Санкт-Петербурге, откуда прибор приходит в виде конструктора.
После сборки чипа его каналы сразу же заполняются жидкостью:
тончайшие капилляры должны постоянно смачиваться, в противном случае
впоследствии они не смогут заполниться питательной средой
«"Человек на чипе" – это лишь первый шаг к цели, но технологии стремительно развиваются, и уже в ближайшее время будет создана более совершенная модель», – делится своим видением академик Тоневицкий. В ближайших планах лаборатории создание чипа, на котором можно разместить десять и более культур клеток одновременно, а не шесть, как сейчас. Так же важно сделать клеточные модели наиболее близкими к реальным структурам в организме человека. Ведь не надо забывать, что сейчас мы имеем дело всего лишь с несколькими тысячами клеток в ячейке, а реальные органы имеют сложное, дифференцированное строение с тканями, непредсказуемо взаимодействующими друг с другом. Наиболее сложна для эксперимента эндокринная система, в которой сотни разных гормонов нацелены на сотни различных мишеней по всему организму.
Ученые «БиоКлиникума» идут по пути совмещения живого с неживым: новая версия чипа, пока находящаяся в разработке, имеет полупроницаемые каналы, по которым циркулирует воздух, – аналог человеческих легких. Кишечник нового маленького человечка будет иметь изгибы, похожие на изгибы реального прототипа, и клетки будут расположены в нужном порядке. В лаборатории уверены в том, что проект будет совершенствоваться до тех пор, пока не удастся смоделировать все системы органов во всем их многообразии.
Этика будущего
Несмотря на то что «человек на чипе» выводит животных и человека из-под удара испытаний лекарств, многие, возможно, задаются вопросом – а не могут ли испытуемые клетки сами испытывать боль, особенно когда речь заходит об экспериментах над нервной системой? К счастью, опасения напрасны, клетки культивируются раздельно и не имеют иннервации. Это лишь комочки живой ткани, объединенные в систему, а не полноценный организм, поэтому говорить о создании искусственной жизни не приходится.
Между тем микробиореактор может не только сократить количество тестов на животных, но и значительно ускорить прогресс как в фармацевтике, так и в медицине. На определенном этапе развития новая технология позволит точно подбирать гормональную терапию и минимизировать риски при подборе лекарств.
«Гомункулус» – полностью российский проект, который получает гранты от Минобрнауки и Минздрава; уже выданы разрешения на испытания новых лекарств, есть и международные контакты. Сейчас «БиоКлиникум» испытывает свои системы в России и Германии, ведь важно доказать правильность работы установки покупателям по всему миру, а не только на отечественном рынке. Когда прибор пройдет все испытания и получит полную сертификацию, его внедрение не заставит себя ждать, и, возможно, совсем скоро мы получим множество спасительных препаратов, созданных благодаря молчаливому «подвигу» множества «человечков» на чипах.
КАК ЛЮДИ ДЕЛАЮТ ЛЮДЕЙ
Сердце биореактора – чип с ячейками для клеток – представляет собой сэндвич из поликарбоната, полидиметилсилоксана (ПДМС) и стекла, соединенных весьма неочевидными высокотехнологичными способами.
1. Силиконовый слой служит кровеносной системой чипа и содержит рисунок из мельчайших каналов глубиной всего 100 мкм. Чтобы изготовить его, в металлическую форму с выпуклым рисунком (те самые 100 мкм) закладывают пластину из поликарбоната. Форма закрывается, в нее вставляются воронки с ПДС, и вся конструкция отправляется в подогреваемую центрифугу, тоже разработанную в центре. Там силикон разогревается до 70 градусов, становится жидким и легко занимает свое место между формой и пластинкой.
2. Получившийся «полуфабрикат» нужно закрыть предметным стеклом, но сделать это непросто. Стекло должно не только плотно закрывать сосуды, но и не оказывать влияния на результаты тестов. Следовательно, клей использовать нельзя. Решили эту задачу путем обработки обеих половинок в плазменной печи. Плазма активирует поверхности силикона и стекла, делает их гидрофильными, а также повышает их способность слипаться. После обработки стекло и силикон соединяют, и сэндвич уже не разделить
3. В «чистой комнате», куда, как правило, не пускают посторонних, покоятся различные культуры клеток в жидком азоте. Для того чтобы из клеточного мороженого они превратились в материал для исследования, их в течение нескольких дней раздельно культивируют. Так как разным типам клеток требуется разное время для дифференциации, то есть разделения по форме, строению и функциям, выращивать их начинают с промежутком до нескольких дней, чтобы к началу эксперимента все были на одной стадии развития.
4. Как только модели органов готовы, их помещают в трансвелы. Чипы распаковывают из стерильных пакетов и заправляют клетками. На протяжении всей сборки чип находится в стерильных условиях, чтобы ни одна посторонняя клетка не попала внутрь. Весь процесс сборки осуществляется в одной лаборатории одним специалистом, что делает разработку еще удобнее в применении.
