CRISPR-Cas9 стала еще точнее

Исследователи университета Калифорнии в Беркли и центральной больницы штата Массачусетс идентифицировали ключевой регион белка Cas9, регулирующий точность взаимодействия системы CRISPR-Cas9 с целевой последовательностью ДНК. Это позволило им создать исключительно точный редактор генов, обеспечивающий наиболее низкий на сегодняшний день уровень ошибочных разрезов ДНК.

Белок Cas9 (серого цвета) представляет собой РНК-направляемую нуклеазу, которую можно запрограммировать на связывание и разрезание любой целевой последовательности ДНК (темно-синяя двойная спираль), что делает ее мощным инструментом для редактирования генома. После связывания с мишенью домены белка Cas9 претерпевают конформационные перестройки (перемещения отдельных аминокислот представлены цветными полосками), обеспечивая активацию комплекса Cas9-sgRNA для прицельного разрезания ДНК. Домен REC3 (голубого цвета) отвечает за распознавание мишени, что является сигналом к ротации наружу домена REC2 (сиреневого цвета), открывающей проход нуклеазному домену HNH (желтого цвета). Эта активная конформация Cas9 обладает способностью запускать согласованное разрезание двух цепочек ДНК-мишени.

Система CRISPR-Cas9 в настоящее время используется для прицельного разрезания молекул ДНК и их последующего редактирования. Исследователи постоянно работают над повышением точности этого подхода. Одной из стратегий этого поиска является создание мутаций в REC3 – главном домене белка Cas9 – и оценка их положительного влияния на точность метода без снижения эффективности в отношении количества неточных разрезов. Эксперименты показали, что даже незначительные изменения домена REC3 влияют на количественное соотношение между точными и неточными разрезами.

В своей последней работе авторы использовали методику, известную как одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции, для точного изучения того, как различные домены белкового комплекса Cas9-РНК двигаются при его связывании с ДНК.

Это позволило им установить, что домен REC3 ответственен за определение точности связывания с мишенью, что является сигналом к ротации наружу домена REC2, открывающей проход нуклеазному домену HNH, активируя «ножницы». Эта активная конформация Cas9 обладает способностью запускать согласованное разрезание двух цепочек ДНК-мишени.

После этого исследователи показали, что путем мутирования разных регионов REC3 можно изменять специфичность белка Cas9 таким образом, что нуклеаза HNH активируется только когда направляющая РНК и специфичный фрагмент ДНК-мишени находятся в непосредственной близости. Им удалось создать улучшенную гипер-точную Cas9, получившую название HypaCas9. В человеческих клетках новая версия фермента несколько лучше отличает целевые регионы ДНК от нецелевых при сохранении эффективности воздействия на целевые фрагменты.

Авторы надеются, что изучение взаимосвязи между структурой, функциями и динамикой Cas9 позволит им создать еще более чувствительные и эффективные вариации фермента для внесения в ДНК различных модификаций.

Статья Janice S. Chen et al. Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy http://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature24268.html опубликована в журнале Nature.

27.09.2017 Источник: vechnayamolodost.ru по материалам University of California, Berkeley: Discovery helps engineer more accurate Cas9s for CRISPR editing.