Структура FOXO4

Модифицированный натуральный белок, синтезированный нидерландскими, австрийскими и американскими учеными, устранил токсические эффекты химиотерапии и физиологические признаки старения у мышей путем прицельного удаления состарившихся клеток. Результаты работы опубликованы в журнале Cell.

Репликативное старение клеток, или сенесценция — это состояние, при котором клетки с накопленными повреждениями ДНК и истощением механизмов ее восстановления перестают делиться. Оно служит природным механизмом защиты от развития рака, но переводит клеточный метаболизм на синтез веществ, активирующих воспалительные реакции и оксидативный стресс (повреждение клеточных структур активными формами кислорода). Клетка может находиться в таком состоянии длительное время, не подвергаясь апоптозу (запрограммированной гибели). Накопление состарившихся, или сенесцентных клеток приводит к возрастным изменениям тканей и всего организма.

В поисках клеточных механизмов, предохраняющих сенесцентные клетки от апоптоза, сотрудники Университета Эразма, Медицинского университета Граца и Баковского исследовательского института старения проанализировали транскриптом нормальных и искусственно состаренных радиацией человеческих фибробластов.

Оказалось, что в состарившихся клетках активированы отвечающие за апоптоз гены, однако их действию препятствует фактор транскрипции FOXO4. Подавление экспрессии этого фактора синтетической РНК резко снижало жизнеспособность таких клеток. Дальнейшие эксперименты показали, что FOXO4 накапливается в области стойко поврежденных участков ДНК (DNA-SCARS) рядом с важнейшим противоопухолевым белком р53, регулирующим апоптоз, и может взаимодействовать с этим белком, препятствуя гибели сенесцентной клетки.

Чтобы выяснить роль этого взаимодействия, ученые синтезировали FOXO4 с модифицированным участком связывания с р53. Полученный белок FOXO4-DRI препятствовал взаимодействию FOXO4 с р53 in vitro. Повысив липофильность FOXO4-DRI для облегчения его проникновения в клетку, исследователи ввели его в культуру состаренных фибробластов и убедились, что это вещество обеспечивает выход р53 из ядра и стимулирует апоптоз.

Действие FOXO4-DRI на уровне молекул, клеток, тканей и организма

После этого FOXO4-DRI испытали на мышах с тремя моделями старения: вызванного химиотерапевтическим препаратом доксорубицином, ускоренного генетической модификацией и естественного. Выяснилось, что это вещество селективно действует на сенесцентные клетки, вызывая их апоптоз. Это, в свою очередь приводило к восстановлению функций печени, нарушенных доксорубицином, а также обращало такие возрастные изменения как снижение выносливости, ухудшение функции почек и облысение у животных со всеми типами старения. Выраженных побочных эффектов при этом не наблюдалось.

Одна и та же мышь до и после терапии FOXO4-DRI

«Таким образом, терапия, направленная на состарившиеся клетки, целесообразна, когда [возрастное] ухудшение здоровья уже наступило, и может эффективно восстановить тканевой гомеостаз», — пишут авторы работы. Будет ли терапия FOXO4-DRI эффективной и безопасной у людей, предстоит выяснить в последующих экспериментах.

Ранее ученые на треть продлили жизнь генетически модифицированных мышей, у которых сенесцентные клетки погибали под действием специально созданного синтетического препарата — этот эксперимент подтвердил роль таких клеток в старении организма. Другому научному коллективу удалось обратить процесс сенесценции клеток путем удаления из них митохондрий.

24.03.2017 Источник: Олег Лищук nplus1.ru

Что умеет ДНК, кроме передачи информации, как она работает вне клетки и можем ли мы это использовать

ДНК — ключевая молекула, несущая генетическую информацию о белках организма. В клетках она находится в ядре и митохондриях (кроме бактерий, у которых ядра и митохондрий нет). Клетка умеет эту информацию считывать, то есть синтезировать закодированные в ней белки, и передавать по наследству дочерним клеткам. Однако ДНК можно обнаружить не только внутри клеток, но и снаружи — такие молекулы назвали внеклеточной ДНК (вкДНК). Они существуют в тканях сами по себе и влияют на функционирование окружающих клеток.

Как это так — ДНК вне клетки?

Клетки бактерий могут выделять ДНК в окружающую среду — это связано с процессами их размножения и обмена информацией. Так, например, распространяется устойчивость к антибиотикам: одна бактерия приобретает соответствующий ген, копирует и делится им с остальной популяцией. У эукариотических (ядерных) организмов подобные процессы долгое время были неизвестны: полагали, что они используют ДНК только для хранения, считывания и передачи информации.

Но в 1948 году в плазме крови обнаружили внеклеточную ДНК — фракцию ДНК, не связанную с клетками и существующую отдельно от них. За последующие годы ученые нашли такую ДНК у всех исследованных организмов, от растений до животных и человека. Ее находили в межклеточном веществе, в циркулирующих жидкостях и даже в отдельно взятых культурах клеток. Похоже, что ДНК вне клеток встречается регулярно и, следовательно, может играть определенную роль в жизни организма.

Внеклеточная ДНК не похожа на обычную.

Геномная ДНК состоит из длинных нитей-хромосом, а вкДНК — набор небольших последовательностей, иногда в миллион раз короче хромосомы.

Случаен ли выбор этих последовательностей или нет — до сих пор остается спорным вопросом.

Внеклеточная ДНК не всегда находится в растворе сама по себе. Иногда она связана с гистонами — белками, которые клетка использует для компактной упаковки нитей ДНК в ядре. В других случаях вкДНК может встречаться внутри экзосом — пузырьков, окруженных мембраной, которые отпочковываются от клеток, путешествуют по организму и могут сливаться с другими клетками. Более того, одна группа ученых выделила из крови животных целый комплекс из ДНК, жиров и белков, отвечающих за ее копирование. То есть, вероятно, по организму плавают целые молекулярные машины, копирующие и распространяющие информацию прямо на ходу. Впрочем, какую часть от общей вкДНК составляют такие структуры, пока неизвестно.

Откуда появляется внеклеточная ДНК?

Кажется логичным, что вкДНК не образуется сама, а выделяется клетками. Что может заставить клетки выбрасывать наружу молекулы, несущие их наследственную информацию?

Гипотеза клеточной гибели предполагает, что ДНК высвобождается, когда разрушаются клетки. Эта теория помогает объяснить, почему вкДНК представлена маленькими фрагментами: например, при апоптозе (программируемой клеточной гибели) ДНК внутри клетки разрезается на небольшие участки, прежде чем вся клетка распадается. Также это согласуется с тем, что в состояниях, сопровождающихся гибелью клеток (инфаркт миокарда, ожоги), количество вкДНК в крови увеличивается.

Но не все так просто: внеклеточную ДНК находили в любых тканевых культурах, даже там, где не было массовой гибели клеток. Это пытается объяснить гипотеза «метаболической ДНК»: вероятно, клетки в ходе своей жизнедеятельности постоянно синтезируют новую ДНК, увеличивая количество копий информации, чтобы удобнее было ее считывать. Cо временем молекулы ДНК изнашиваются и клетки выделяют их в окружающую среду вместе с продуктами обмена веществ.

Существует и мнение, что выделение вкДНК — это способ клеток обмениваться сигналами. Так, например, из разных внутриорганизменных жидкостей были выделены мембранные пузырьки, содержащие небольшие количества ДНК. Такие пузырьки могут сливаться с клетками, передавая им молекулы ДНК.

 

Изображение: Алиса Муравьева

 

У меня в крови нашли ДНК. Это плохо?

Внеклеточная ДНК — естественный компонент плазмы крови, и ее можно обнаружить у любого человека. В норме ее концентрация довольно низкая, хотя и может варьировать, но в случае патологических и стрессовых состояний количество вкДНК резко вырастает. Например, при ожогах или заболеваниях, связанных с массовой гибелью клеток, — инфаркте миокарда или ревматоидном артрите. Даже у здорового человека возможны сильные колебания уровня вкДНК, если он подвергается стрессу, например сильной физической нагрузке. Однако после прекращения нагрузки концентрации возвращаются к нормальным значениям.

Сложнее обстоит дело при онкологических заболеваниях. Не до конца понятно, откуда в этом случае возникает вкДНК — в результате гибели здоровых тканей или как продукт целенаправленного выделения опухолевых клеток. Тем не менее ее количество также сильно отличается от нормы.

Пока медицина не научилась диагностировать конкретные заболевания по концентрации вкДНК в крови, однако уже можно оценивать тяжесть состояния и прогнозировать развитие болезни.

Так, если сравнить количества вкДНК у людей, перенесших инфаркт миокарда, то оказывается, что чем больше вкДНК, тем сильнее осложнения и риск повторного инфаркта или остановки сердца.

Возможно, тщательное изучение последовательностей вкДНК поможет ставить более точные диагнозы. На это делают ставку и в области пренатальной диагностики: в крови матери присутствует вкДНК плода, а это значит, что можно получить генетический материал ребенка без оперативного вмешательства. Это открывает широкое поле для генетических анализов — для выявления болезней плода (например, резус-конфликта) или определения пола.

Что клетки «думают» о внеклеточной ДНК?

Внеклеточная ДНК постоянно присутствует вокруг клеток, и можно предположить, что изменение ее концентрации или свойств послужит сигналом, на который другие клетки отреагируют.

На некоторые клетки повышение концентрации вкДНК оказывает активирующий эффект. Клетки иммунной системы способны запускать иммунный ответ при распознавании вкДНК. Это происходит за счет механизма, который в норме отвечает за реакцию на молекулы чужеродной, например вирусной, ДНК в крови. Те же самые рецепторы, которые узнают вирусную ДНК, реагируют и на собственную вкДНК организма, активируя клетки иммунной системы.

Для других клеток вкДНК может работать как сигнал тревоги — в них развивается «эффект свидетеля». Допустим, у нас есть культура клеток, подвергающаяся стрессу: низкий уровень кислорода, облучение или другие аномальные условия. В этих клетках ДНК повреждается и развивается окислительный стресс — накапливаются агрессивные вещества, разрушающие клеточное содержимое. Если перенести вкДНК, выделенную пострадавшими клетками, на культуру здоровых клеток, то в них также начинают обнаруживаться повреждения ДНК и окислительный стресс. Такие клетки называют «свидетелями», так как они переживают стресс, не подвергаясь действию изначальных факторов.

 

Изображение: Алиса Муравьева

 

Однако этим эффекты вкДНК не исчерпываются: она может стимулировать или замедлять деление клеток, влиять на активность генов и синтез белка. Судя по всему, вкДНК оказывает на многие клетки системный эффект, изменяя их физиологию, но конкретная его природа пока остается загадочной.

Что мы еще (не)знаем о внеклеточной ДНК?

В последнее время появились данные о том, что клетки животных и человека могут поглощать вкДНК из крови. В некоторых случаях эти молекулы достигают клеточного ядра, проникают внутрь и встраиваются в собственный геном клетки. Часто интеграция такой блуждающей молекулы вкДНК в геном заканчивается повреждением ДНК клетки-реципиента и ее гибелью. Но если встраивание оказывается успешным, процессы считывания информации меняются: фрагменты бывшей вкДНК блокируют работу генов в ядре клетки или запускают считывание собственной информации. Таким образом, перед нами особенный механизм межклеточного взаимодействия — обмен генетической информацией.

Этот механизм, вероятно, играет важную роль в развитии заболеваний. Несколько лет назад была сформулирована концепция «генного метастаза»: предполагается, что опухолевые клетки могут выделять множественные копии своих мутантных генов. Здоровые клетки их поглощают, интегрируют в свой геном и начинают производить мутантные опухолевые белки.

Похожие процессы теоретически могут происходить и при взаимодействии клеток разных организмов. Хотя вкДНК плода обнаруживается в крови матери, пока нет сведений о ее поглощении клетками. Зато обнаружено, что при переливании крови не только клетки донора поселяются в организме реципиента, но и вкДНК донора может интегрировать в клетки реципиента.

Исследования функций внеклеточной ДНК начались относительно недавно, однако уже можно говорить об открытии принципиально нового механизма коммуникации как между клетками в пределах организма, так, вероятно, и между самими организмами.

 

16.03.2017 Источник: Полина Лосева chrdk.ru

Биологи придумали способ получать жизнеспособные эритроциты in vitro в количествах, пригодных для клинического применения. Для этого они создали «бессмертную» линию клеток-предшественников эритроцитов. Статья опубликована в журнале Nature Communications.

Ранее красные кровяные клетки пытались получать, дифференцируя стволовые клетки, полученные от доноров. Такие клетки плюрипотентны (способны дифференцироваться в любой тип клеток организма), поэтому для получения именно эритроцитов необходимо прибегать к сложным манипуляциям. Такой способ работает, но дает небольшое количество клеток, из-за чего приходится брать у доноров кровь много раз.

Другой подход заключается в том, что бы использовать не плюрипотентные клетки, а унипотентные — способные дифференцироваться только в один тип клеток. Если культивировать унипотентные предшественники эритроцитов, можно не заботиться о контроле их дифференцировки. Однако в отличие от стволовых, количество делений таких клеток ограничено, поэтому их необходимо иммортализовать — модифицировать так, чтобы они делились бесконечно.

Этим подходом и занялись ученые из Бристольского университета. Они взяли клетки костного мозга и генетически модифицировали их, добавив гены папилломавируса человека, которые позволяют клетке делиться неограниченно. Затем авторы работы индуцировали переход клеток в предшественники эритроцитов. Ход дифференцировки новой клеточной линии, названной BEL-A (Bristol Erythroid Line Adult), не отличается от соответствующих стадий развития плюрипотентных клеток. Отличий в морфологии эритроцитов также не обнаружено.

Если клинические испытания пройдут успешно, то выращенные эритроциты станут ценным материалом для переливаний. Это снизит риск передачи инфекционных заболеваний, а также поможет в первую очередь больным с редкими группами крови. Линии иммортализованных предшественников могут быть созданы для любой группы крови.

27.03.2017 Источник: Анна Образцова nplus1.ru

Сканирующая электронная микрофотография раковых клеток легкого в псевдоцвете

Мутации, способные вызывать рак, обычно относят к двум основным категориям: наследственные и те, что возникли в результате воздействия окружающей среды. Американские ученые показали, что не менее существенным является и третий источник появления мутаций — неизбежные ошибки, возникающие в ходе удвоения ДНК. В некоторых случаях их вклад составляет более 95 процентов. Исследование опубликовано в Science .

Согласно последним данным Международной Ассоциации Изучения Рака (IARC), онкологические заболевания — самая распространенная причина смерти на нашей планете. Одной из главных причин их возникновения являются изменения в последовательности ДНК, которые называются мутациями. Мутации можно получить по наследству от родителей (Н-мутации) или в результате воздействия внешней среды (С-мутации) — например, из-за курения или воздействия радиоактивного излучения. Кроме того, случайные ошибки (Р-мутации) возникают и в ходе обычного процесса репликации ДНК, например, когда фермент полимераза, строящий новую цепочку по шаблону уже имеющейся, по ошибке вставляет туда неправильные нуклеотиды-буквы. Среди других причин Р-мутаций — квантовые эффекты, влияние эндогенных активных форм кислорода и гидролитическое дезаминирование нуклеотидов.

Подсчитано, что каждый раз, когда человеческая клетка делится, у нее появляется около трех новых мутаций. Большинство этих мутаций проходит совершенно незаметно для организма, более того, ошибки репликации — это необходимая движущая сила эволюции; однако известно, что некоторые из таких мутаций или их сочетаний могут оказаться канцерогенными. Количественный вклад Р-мутаций в возникновение опасных изменений до сих пор был, однако, не вполне ясен.

Клетки, которые уже стали раковыми, прекращают свою обычную работу и начинают быстро и неконтролируемо делиться, что приводит к возникновению опухолей. Обычные же клетки обладают совершенно разной способностью к делению. Эпителий, например, занимается этим постоянно, а сформированные нейроны — вообще никогда этого не делают, и при попытках заставить их делиться в лабораторных условиях гибнут. Риск развития рака у разных тканей тоже совершенно разный, и именно это и натолкнуло исследователей на мысль о том, что причина может крыться в процессе удвоения ДНК перед делением клетки.

В эксперименте ученые исследовали взаимосвязь между скоростью репликации стволовых клеток и вероятностью возникновения онкологических заболеваний. Для этого они оценивали количество поделившихся стволовых клеток у пациентов разных возрастов и соотносили эти числа с медицинскими данными базы IARC. Оценивая вклад разных процессов, приводящих к появлению опасных мутаций, исследователи предполагали, что Р-мутаций у индивидов одного возраста будет примерно одинаковое количество, поскольку деление стволовых клеток у всех происходит примерно с одинаковой скоростью, в то время как уровни Н-мутаций или С-мутаций у разных людей могут сильно различаться. Чтобы принять во внимание влияние внешней среды, ареал исследований, первоначально проводящихся в США, был расширен до 69 разных стран и охватил в результате самые разнообразные экологические условия, 17 типов раковых заболеваний и пациентов всех возрастов.

Выяснилось, что вероятность заболеть определенным типом рака очень сильно зависит от способности клеток соответствующей ткани к делению, и, таким образом, доля репликационных ошибок среди канцерогенных мутаций очень высока. Коэффициент зависимости риска развития заболевания от скорости деления стволовых клеток везде превысил 0,7. Медиана этой корреляции составила 0,8. Это удивительные цифры — ученые предполагали, что вклад разных экологических условий сделает такой анализ невозможным, но влияние Р-мутаций оказалось неожиданно сильным.

Чтобы количественно оценить долю Р-мутаций среди всех канцерогенных изменений ДНК человека, было проведено отдельное независимое исследование. В исследуемой модели числа Н-мутаций и С-мутаций были сначала приняты за ноль. В такой прекрасной гипотетической популяции, очищенной от наследственных раковых мутаций и живущей в идеальных экологических условиях, все равно будет возникать рак — как следствие Р-мутаций. Добавляя в такую модель разные факторы, которые увеличивают влияние С-мутаций, и учитывая уже известные Н-мутации можно при сравнении результатов понять, какие мутации откуда появились.

Для того, чтобы получить соответствующие числа, ученые вначале воспользовались результатами геномного секвенирования и эпидимеологическими данными для пациентов с аденокарциномой легких (для нее не известно наследственных мутаций, но показана очень сильная корреляция с курением и менее сильная — с ионизирующим излучением, загрязнением воздуха, «пассивным» курением и другими факторами внешней среды). Расчеты проводили следующим образом: если у пациента, который курил, число мутаций было, например, в три раза большим по сравнению с некурящим пациентом, то вклад С-мутаций для них оценивался как две трети, а Р-мутаций — как одна треть. Таким образом посчитали вклад обоих типов мутаций для выборки из 20 пациентов. Выяснилось, что число канцерогенных Р-мутаций составляет в среднем 35 процентов. Согласно данным Cancer Research UK, 89 процентов случаев заболевания аденокарциномой легких можно предотвратить, если не курить, но это не противоречит тому факту, что Р-мутации у некурящих все равно будут накапливаться с той же скоростью.

После этого ученые провели подобный же анализ с экзомными и эпидемиологическими данными, касающимися панкреатической протоковой аденокарциномы, которую тоже можно предотвратить за счет изменения условий жизни, но лишь в лишь в 37 процентах случаев. Н-мутации составили около 5 процентов драйверных (опасных) канцерогенных мутаций этого типа рака, в то время как Р-мутации — целых 77 процентов.

В ходе исследования третьей группы раковых заболеваний, для которых было известно, что факторы среды и наследственные факторы для них, обычно, несущественны (это, например, рак простаты, мозга или костей), ученые подтвердили, что предполагаемые Р-мутации составляют в этом случае 95 процентов канцерогенных драйверных мутаций.

Доля Н-мутаций (наследственных), Р-мутаций (репликационных) и С-мутаций (воздействие среды) в разных типах рака у женщин

Всего в этой части работы было изучено 32 типа рака. Для каждого из них была посчитана доля влияния всех трех типов мутаций. Вклад Р-мутаций в развитие всех раковых заболеваний в Великобритании, например, составил 66 процентов. Стоит лишний раз отметить, что эти данные не противоречат оценкам, согласно которым многие виды рака можно предотвратить путем изменения условий среды. Например, если доля Р-мутаций составляет 50 процентов, и для развития заболевания нужны ошибки в обеих копиях соответствующего гена, то, скорее всего, только одна из них появится в результате Р-мутации, а предотвращение второй может спасти человека.

Важно понимать, что мутагенез — процесс постоянный. Ученые отмечают, что несмотря на то, что канцерогенные Р-мутации предотвратить практически невозможно, нужно стараться отслеживать их возникновение, поскольку ранний диагноз и своевременное лечение раковых заболеваний гораздо чаще приводят к полному выздоровлению пациентов, чем работа с больными на поздних стадиях. Но мутагенез имеет и положительные стороны. Тасманским дьяволам, например, собственные новые мутации помогли быстро справиться с весьма опасным и заразным раком безо всяких лекарств.

27.03.2017 Источник: nplus1.ru