Авторы: Antoine Roux, Chunlian Zhang, Jonathan Paw, José Zavala-Solorio, Twaritha Vijay, Ganesh Kolumam, Cynthia Kenyon, Jacob C. Kimmel

Введение

Почти все многоклеточные животные испытывают старение - процесс прогрессирующего снижения функциональности и устойчивости, который приводит к смерти [1]. Развитие зародышевой линии - единственный известный биологический процесс, способный обратить старение или избежать его эффектов, и способность перепрограммировать клетки до плюрипотентного состояния продемонстрировала, что стадии этого процесса развития могут быть обращены вспять в отдельных клетках [2]. Базисные работы далее продемонстрировали, что клетки могут быть перепрограммированы в состояние индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) посредством индукции четырех факторов транскрипции - Sox2, Pou5f1 (Oct4), Klf4 и Myc (SOKM) [3, 4].

Данные нескольких групп также предполагают, что плюрипотентное перепрограммирование также обращает вспять признаки старения. ИПСК, полученные от молодых и пожилых доноров, в значительной степени неотличимы, и это сходство сохраняется после дифференцировки по  различным клеточным судьбам [5, 6, 7]. Это стирание признаков старения не происходит в протоколах прямого перепрограммирования [7, 8], указывая тем самым, что дедифференцировка во время плюрипотентного перепрограммирования тесно связана с этим феноменом.

Удивительно, что временная индукция SOKM у мышей с использованием индуцибельного аллеля зародышевой линии улучшает множество физиологических функций у старых животных и увеличивает продолжительность жизни у прогероидных мышей [9]. Эта временная стратегия перепрограммирования не генерирует ИПСК, а скорее изменяет экспрессию генов, не индуцируя плюрипотентное состояние в большинстве клеток. Сходным образом, временная индукция факторов транскрипции плюрипотентности, как сообщается, снижает транскрипционные особенности старения во многих типах клеток человека и мыши [10, 11, 12] и улучшает регенеративную способность в мышцах и глазах [10, 11, 13].

Эти поразительные результаты предполагают, что даже временной индукции связанных с плюрипотентностью генных регуляторных сетей (GRN) достаточно для смягчения признаков старения. Однако остается неясным, проявляются ли эти эффекты равномерно во всех клетках и на какой стадии процесса перепрограммирования теряются черты старения. Также неизвестно, подавляет ли временное перепрограммирование GRN, которые устанавливают идентичность соматических клеток. Ранние сообщения предполагали, что временное перепрограммирование не влияет на программы идентификации клеток, но это контрастирует с наблюдениями в экспериментах по перепрограммированию iPSC [14, 15, 16, 17] и известными неопластическими эффектами перепрограммирования in vivo [18, 9]. Точно так же было высказано предположение, что некоторые из положительных эффектов временного перепрограммирования проистекают из повторного включения программ идентификации соматических клеток, но в настоящее время мало доказательств, подтверждающих эту гипотезу.

Необходимость или достаточность индивидуальных факторов плюрипотентности для смягчения признаков старения также неясна. Широко используемые факторы SOKM были идентифицированы на основании их способности вызывать плюрипотентное состояние. Учитывая, что при  временном перепрограммировании этого явно не происходит, вполне вероятно, что лишь часть SOKM GRN необходима для обращения вспять возрастных изменений. Недавние эксперименты показывают, что Myc как минимум не нужен [11]. Также неизвестно, могут ли альтернативные стратегии перепрограммирования, такие как подходы мультипотентного перепрограммирования, также восстанавливать молодой паттерн экспрессии генов, или такие эффекты происходят лишь при активации полной программы плюрипотентности.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы выполнили временное плюрипотентное перепрограммирование с использованием факторов Яманака  адипогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из молодых и старых мышей, и профилировали экспрессию генов с помощью секвенирования РНК одиночных клеток. Мы обнаружили, что временное перепрограммирование восстанавливает молодой паттерн экспрессии генов, но временно подавляет идентичность соматических клеток в обоих типах клеток. Чтобы определить, какие GRN в наборе факторов Яманака были ответственны за эти эффекты, мы выполнили объединенный скрининг для всех возможных комбинаций факторов и обнаружили, что единого фактора не требуется. Мы также протестировали временный режим мультипотентного перепрограммирования в миогенных клетках и обнаружили, что признаки старения частично восстанавливаются.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Временное перепрограммирование восстанавливает молодую экспрессию генов в старых адипогенных клетках

Чтобы оценить эффекты временного перепрограммирования с использованием полного набора факторов Яманака, мы разработали полицистронный тетрациклин-индуцибельный лентивирусный вектор SOKM с конститутивным флуоресцентным репортером (LTV-Y4TF, рис. 1A) [19]. Мы использовали LTV-Y4TF и лентивирус-трансактиватор тетрациклина (LTV-Tet) для трансдукции первичных адипогенных клеток от молодых (2-4 месяца) и старых (20-24 месяцев) мышей C57Bl / 6 in vitro. После трансдукции мы выполнили пульс-чейз, добавляя доксициклин (Dox) в среду для культивирования клеток в течение 3 дней и набдюдая в течение 3 дней (рис. 1B). Мы использовали множественность заражения (multiplicity of infection, MOI), достаточную для трансдукции 50% клеток в каждом состоянии, так что часть клеток в каждой лунке подвергается воздействию Dox, но не содержит обоих трансгенов, необходимых для перепрограммирования. Таким образом, эти клетки служат контролем in situ. Эта экспериментальная схема обеспечивает более короткий индукционный период и более длительный период отслеживания, чем в предыдущих сообщениях [9, 10, 11]. После периода отслеживания мы отсортировали двойные трансген-положительные (Tg +) и одиночные трансген-отрицательные (Tg-) клетки каждого возраста с помощью цитометрии и профилировали клеточные транскриптомы с помощью отдельноклеточного RNA-seq (методы).

Рисунок 1: Временное плюрипотентное перепрограммирование восстанавливает молодую экспрессию генов в адипогенных клетках мышей. (A) Схематическая диаграмма нашего плюрипотентного перепрограммирующего лентивирусного вектора (LTV-Y4TF). Экспрессия полицистрона фактора Яманака контролируется элементом ответа на тетрациклин (TRE). (B) Схема нашего эксперимента по временному плюрипотентному перепрограммированию. Мы провели 3-дневный импульс / 3-дневную погоню за SOKM с использованием индуктора Dox в адипогенных клетках и мышечных МСК молодых и старых мышей. После погони клетки были профилированы с помощью отдельноклеточного РНК-секвенирования. (C) UMAP-проекция профилей мРНК отдельных клеток из молодых и старых адипогенных клеток. Состояния выражений, специфичные для управления и перепрограммирования, аннотируются. Адипогенные состояния маркируются Lpl, секреторные состояния - Rspo1, а специфические состояния перепрограммирования - Snca и Nanog. (D) Контрольная (Tg-) и перепрограммированная (Tg +) популяции молодых и старых клеток выделены во вложении. Контрольные адипогенные клетки делятся на подмножества Hoxc10 +/-. Легко различить молодые и пожилые популяции. (E) Величина связанных с возрастом изменений в экспрессии генов была значительно снижена при обработке Y4TF, как измерено с использованием максимального среднего расхождения (MMD, p 0,001, сумма рангов Вилкоксона). Поэтому старые перепрограммированные клетки ближе к молодому контрольному состоянию, чем старые контрольные клетки. (F) Временное перепрограммирование (Aged Tg +) восстанавливает молодой паттерн экспрессии генов по тысячам генов (значительное изменение в направлении молодости, q 0,10). (G) Анализ обогащения набора генов показывает, что многие генные программы, выключающиеся с возрастом, активируются посредством перепрограммирования и наоборот. Метаболизм жирных кислот был одной из программ молодости , восстанавливаемых перепрограммированием, а воспалительные реакции, усиленные с возрастом, подавлялись перепрограммированием (наборы генов MSigDB Hallmark). (H) Гены программ метаболизма жирных кислот и воспалительной реакции показывают смягчение возрастных изменений во временно перепрограммированных клетках. 

После фильтрации по качеству мы получили в распоряжение 30 000+ профилей мРНК адипогенных клеток. После шумоподавления и уменьшения размерности с помощью вариационного автоэнкодера (методы) [20] мы сгруппировали профили клеток и обнаружили, что перепрограммирование индуцирует набор новых состояний экспрессии генов, невидимых в контрольных клетках (рис. 1C, D). Контрольные клетки находились в адипогенном состоянии, обозначенном Lpl, и секреторном состоянии, обозначенном Rspo1. Подавляющее большинство обработанных клеток занимали клеточные состояния, специфичные для перепрограммирования, что позволяет предположить, что эффекты временного перепрограммирования обладают высокой проникающей способностью. Молодые и старые клетки занимали отдельные области латентного пространства как в контрольной, так и в перепрограммированной популяциях, аналогично предыдущему исследованию контрольных клеток in vivo, предполагая, что некоторые черты старения сохраняются после перепрограммирования (рис. 1D; рис. S1) [21]. . Различия между животными были небольшим источником вариаций (1%, рис. S2, ANOVA, методы).

Сначала мы хотели определить, уменьшилось ли транскрипционное расстояние между молодыми и старыми контрольными клетками - степень старения - при временном перепрограммировании. Мы измерили степень старения, используя максимальное среднее несоответствие (MMD), статистику  репрезентативного обучения, которая измеряет сходство двух популяций и обеспечивает тест на статистическую значимость [22, 23]. Здесь мы вычислили MMD по популяциям клеток, используя скрытые переменные автоэнкодера, чтобы зафиксировать изменения во всем транскриптоме. Мы сравнили как старые контрольные, так и старые перепрограммированные клетки с молодыми контрольными клетками с помощью MMD и обнаружили, что степень старения значительно снизилась после проведения перепрограммирования (рис. 1E, p 0,001, сумма рангов Вилкоксона; методы). Это уменьшение различия молодых и старых клеток демонстрирует, что временное перепрограммирование может восстановить молодой рисунок экспрессии генов в транскриптоме.

Чтобы определить, какие гены вызывают это изменение, мы выполнили анализ дифференциальной экспрессии и обнаружили, что перепрограммирование вызывало значительные изменения  уровня экспрессии в направлении молодости в 3485 генах из 5984 генов, измененных с возрастом (рис. 1F). Перепрограммирование вызывало омоложение значительно чаще, чем можно было ожидать в случае случайных изменений (биномиальный тест, p 0,0001). Мы использовали анализ обогащения набора генов [24] для сравнения транскрипционных эффектов старения и перепрограммирования и обнаружили, что перепрограммирование противодействует возрастным изменениям во многих наборах генов (рис. 1G). Двумя наиболее яркими примерами этого феномена были набор генов адипогенного «метаболизма жирных кислот», подавляющийся с возрастом и активируемый перепрограммированием, и набор генов «воспалительного ответа», активированный с возрастом и подавляющийся перепрограммированием (рис. 1H). Временное перепрограммирование может реконструировать эпигеном, чтобы позволить реактивацию подавленной программы жирных кислот. Мы обнаружили аналогичное подавление адипогенных генов с возрастом в данных по отдельным клеткам, собранным in vivo (рис. S1) [21]. Восстановление этой характерной метаболической программы предполагает, что некоторые функции старых адипогенных клеток могут быть улучшены временным перепрограммированием.

Идентичность клетки диктует эффекты временного перепрограммирования

Затем мы задались вопросом, было ли восстановление молодой экспрессии генов постоянной  особенностью временного перепрограммирования в случае разных типов клеток. Мы провели эксперименты по временному перепрограммированию мезенхимальных стволовых клеток мышечного происхождения [25] для исследования этого вопроса. Мы получили более 20000 профилей МСК и обнаружили, что молодые и старые контрольные клетки были менее различимы, чем в случае адипогенных клеток (рис. S3A, B), но возраст клеток все еще можно было легко определить с помощью классификационной модели (точность 93%, рис. S4). , Методы). Подобно нашим экспериментам на адипогенных клетках, временное перепрограммирование индуцировало новый набор состояний экспрессии генов, специфичных для перепрограммирования, и отсутствующих в контрольных клетках обоих возрастов (рис. S3C). Эти состояния характеризовались подавлением программы перехода эпителия в мезенхиму (EMT) (обогащение набора генов Hallmark из 150 основных дифференциальных генов; точный тест Фишера; q 0,0001). Мы также обнаружили, что молодая экспрессия генов была восстановлена ​​в 712 генах (значительное изменение в направлении молодости), программа фиброзных генов, вызванная старением, была подавлена, а количественная оценка уровня старения, полученная на основе данных массивных последовательностей РНК, уменьшилась (рис. . S5).

Однако, когда мы вычислили величину старения в MSC, мы обнаружили, что старые клетки были более отличными от молодых контрольных после перепрограммирования (Рис. S3F). Этот результат, вероятно, был связан с тем, что более 4000 генов были значительно изменены при перепрограммировании, но не с возрастом. Мы предположили, что в MSC степень старения может быть меньше, чем в адипогенных клетках, так что ортогональные эффекты перепрограммирования доминируют в контексте MSC. Мы проверили эту гипотезу, сравнив величину старения в контрольных адипогенных клетках и MSC в общем латентном транскрипционном пространстве и обнаружили, что старение вызывает значительно больший сдвиг экспрессии генов в адипогенных клетках (рис. S6A, C; методы). Эти результаты предполагают, что в некоторых типах клеток временные эффекты перепрограммирования, не связанные с возрастом клеток, могут доминировать.

Мы также предположили, что перепрограммирование может вызывать эффекты, специфичные для некоторых типов клеток. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили анализ дифференциальной экспрессии для выявления как перепрограммирование влияет на разные типы клеток (методы). Этот анализ выявил более 10 000 генов, для которых перепрограммирование вызывало существенно разные эффекты (q 0,05, тест отношения правдоподобия, регрессия препятствий). Мы также обнаружили, что 11% неостаточных вариаций объясняются специфическими для типов клеток эффектами перепрограммирования в общем латентном транскрипционном пространстве (рис. S6B, ANOVA).

Чтобы выяснить влияние типа клеток на результаты временного перепрограммирования, мы извлекли главные гены со значимым разбросом влияния перепрограммирования на разные типы клеток  и выполнили анализ онтологии генов. Программы внеклеточного матрикса и EMT были подавлены перепрограммированием в обоих типах клеток, но значительно меньше в адипогенных клетках. Напротив, наборы генов гипоксии и гликолиза в большей степени регулируются перепрограммированием в MSC, чем в адипогенных клетках (рис. S6E, q 0,05, точный тест Фишера). Исследование отдельных генов подтвердило влияние типа клеток на эффекты перепрограммирования в этих генных программах (рис. S6D, F). Таким образом, идентичность соматических клеток определяет эффекты временного перепрограммирования многих генов, предполагая, что молодой паттерн экспрессии генов в одних типах клеток может быть восстановлен ​​более эффективно, чем в других.

 Идентичности соматических клеток подавляются временным перепрограммированием

Основываясь на наших наблюдениях за новыми состояниями клеток во временно перепрограммированных адипогенных клетках и MSC, мы предположили, что регуляторные сети генов, обеспечивающие идентичность соматических клеток, могут быть репрессированы, даже если факторы перепрограммирования экспрессируются только временно. Учитывая континуум состояний перепрограммирования, которые мы наблюдали, непрерывная система координат, назначающая каждой ячейке позицию на траектории перепрограммирования, позволяет проводить скупой анализ. Чтобы построить систему координат для кратковременного перепрограммирования, мы использовали псевдовременной анализ, метод для вывода непрерывных процессов с использованием отношений между ячейками, профилированных в один момент времени (рис. 2A, C; методы) [26].

Рисунок 2: Идентичность соматических клеток подавляется временным перепрограммированием и повторно приобретается посредством вторичной дифференцировки.(A) Временное перепрограммирование в адипогенных клетках индуцирует непрерывную траекторию перепрограммирования специфичных клеточных состояний. Мы зафиксировали эту траекторию количественно с помощью диффузионной псевдовременной координаты. Скорость РНК (стрелки) предсказывала, что клетки в специфичных для перепрограммирования состояниях дифференцируются в направлении идентичности контрольных клеток. (B) Связанные с плюрипотентностью гены Nanog и Snca были индуцированы в наиболее дистальных состояниях перепрограммирования, в то время как гены идентичности адипоцитов Lpl и Fabp4 были подавлены (значения соответствия GAM, среднее ± 95% ДИ). (C) MSC, полученные из мышц, демонстрируют сходную траекторию состояний перепрограммирования. Скорость РНК аналогичным образом предсказывала, что MSC в специфичных для перепрограммирования состояниях повторно дифференцируются в направлении своей исходной идентичности соматических клеток. (D) Гены, ассоциированные с плюрипотентностью, также индуцировались в дистальных состояниях перепрограммирования MSC, в то время как гены мезенхимальной идентичности Thy1 и Col1a1 подавлены. (E) Программная активность мезенхимальной идентичности, выведенная с использованием классификаторов типов клеток и набора данных атласа клеток мыши, оцененных по псевдовремени (слева) и проецируемых в латентные пространства транскрипции (справа). Программы мезенхимальной идентичности подавлялись в дистальных состояниях перепрограммирования для обоих типов клеток, в то время как энтропия идентичности клеток возрастала (p 0,01, тест Вальда). (F) Обогащенный анализ онтологии генов показывает, что эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), внеклеточный матрикс (ECM) и гены передачи сигналов клетки являются основными движущими силами скорости РНК. (G) Траектории состояния клеток моделировались на основе оценок скорости РНК в каждом типе клеток. Смоделированные клетки были запущены в состояниях перепрограммирования и итеративно обновлялись, чтобы предсказать их будущую экспрессию. Моделируемые клетки дифференцировались в сторону состояний соматических клеток в обоих типах клеток (слева). Расстояние между смоделированными перепрограммированными клетками и состоянием контрольных клеток значительно уменьшилось (справа) после 500 временных шагов в поле скорости РНК (n = 1000 симуляций; p 0,01, t-критерий для одного образца). 

Мы сначала исследовали эффекты временного перепрограммирования на отдельные маркерные гены для идентичности соматических клеток через псевдовременные траектории. В адипогенных клетках мы обнаружили, что адипогенные гены Lpl и Fabp4 были значительно подавлены в наиболее дистальных перепрограммированных клетках, тогда как ассоциированные с плюрипотентностью гены Nanog, Snca и Fgf13 были активированы (рис. 2B, методы). Мы обнаружили сходный паттерн в MSC, где мезенхимные гены Acta2, Thy1 и Col1a1 подавлялись, в то время как Nanog, Snca и Fgf13 подавлялись (Рис. 2D). Активация Nanog и других генов плюрипотентности после 2-4-дневной индукции SOKM согласуется с предыдущими исследованиями отдельно-клеточного времени перепрограммирования iPSC (Fig. S7) [27]. Важно отметить, что активация Nanog также была предложена как «точка невозврата», в которой некоторые клетки могут не восстановить соматическую идентичность [28]. Затем мы суммировали активность GRN идентичности клеток, используя методы вывода регуляторных сетей [29, 30] и модель классификации идентичности клеток (scNym), обученную на атласе клеток мыши и наших данных [31, 32]. Мы обнаружили, что программы идентичности соматических клеток были значительно подавлены в дистальных состояниях перепрограммирования для обоих типов клеток с использованием обоих подходов к анализу (рис. 2E; рис. S8; p 0,05, тест Вальда для предсказаний идентичности клеток).

Эти результаты контрастируют с предыдущими сообщениями о том, что временное перепрограммирование не подавляет идентичность соматических клеток или не активирует гены плюрипотентности [10, 11]. Чем можно объяснить эту разницу? Предыдущие исследования основывались на измерении небольшого набора маркерных генов в массовых профилях транскрипции. Эти анализы, возможно, не зафиксировали подавление идентичности клеток или активацию генов плюрипотентности в субпопуляции клеток. Таким образом, наше профилирование отдельных клеток может улавливать эффекты экспрессии генов, которые маскируются при массовых измерениях. Подтверждая эту точку зрения, наши измерения отдельных клеток согласуются с исследованиями по отслеживанию клонов, показывающими, что временные импульсы SOKM индуцируют экспрессию Nanog и достаточны для создания плюрипотентных колоний [15]. Наши результаты предполагают, что временное перепрограммирование репрессирует GRN идентичности соматических клеток и активирует GRN поздней стадии плюрипотентности по крайней мере в субпопуляции клеток в нескольких типах клеток, потенциально создавая неопластический риск.

Кратковременно перепрограммированные клетки повторно приобретают соматические идентичности посредством вторичной дифференцировки.

Было высказано предположение, что временная экспрессия факторов перепрограммирования индуцирует временный процесс де-дифференцировки и ре-дифференцировки, так что перепрограммированные клетки временно принимают свойства ранних фаз перепрограммирования, но затем снова обретают свое исходное состояние [33, 28, 10]. На сегодняшний день существует мало доказательств в пользу этой модели в контексте восстановления экспрессии генов в молодости. В дополнение к обширным профилям текущего состояния клетки, отдельно-клеточная RNA-seq предоставляет информацию о будущих состояниях экспрессии генов через скорость РНК, что позволяет нам исследовать направление изменения клеточного состояния по этой траектории [34]. Скорость РНК определяет скорость изменения для каждого гена на основе относительного соотношения сплайсированных и несплайсированных транскриптов при предположении, что несплайсированные транскрипты представляют собой зарождающиеся или вновь транскрибируемые сообщения.

Мы сделали вывод о скорости РНК как для наших экспериментов с адипогенными клетками, так и для MSC и обнаружили, что карты скоростей в обоих типах клеток предполагают, что перепрограммированные клетки повторно дифференцируются к своему базовому состоянию (Рис. 2A, C) [35]. Чтобы идентифицировать гены, которые управляют предсказанными изменениями состояния клеток, мы провели анализ дифференциальной скорости. В обоих типах клеток мы обнаружили, что наборы генов EMT и внеклеточного матрикса были обогащены маркерами скорости у перепрограммированных клеток, подтверждая, что временно перепрограммированные клетки повторно приобретают свои исходные мезенхимальные идентичности (Рис. 2F).

Мы дополнительно количественно оценили карты скоростей РНК, используя фазовое моделирование, метод динамических систем для измерения свойств векторных полей путем моделирования движения точки, движущейся через поле [36, 23, 37]. Здесь мы смоделировали перепрограммированные клетки на каждой карте скоростей и развили их положения на основе предполагаемых скоростей соседних клеток (методы). Мы обнаружили, что фазовые точки, инициализированные в перепрограммированных состояниях, эволюционировали в направлении контроля состояний соматических клеток в обоих типах клеток (рис. 2G). В сочетании с нашим предыдущим результатом, наши  анализы отдельных клеток предоставляют первое прямое доказательство того, что восстановление молодой экспрессии генов включает временное подавление GRN идентичности клеток и последующую повторную дифференцировку и реактивацию этих сетей.

Подмножеств факторов Яманака достаточно, чтобы вызвать временные эффекты перепрограммирования.

Исследования временного перепрограммирования в старых клетках в значительной степени исследовали эффекты канонических факторов Yamanaka (SOKM) вместе с дополнительными регуляторами плюрипотентности, которые, как известно, индуцируют плюрипотентность (Nanog, Lin28) [10, 4]. Программы плюрипотентности, активируемые факторами Яманака, содержат положительную обратную связь, поэтому вполне возможно, что подмножество факторов является достаточным для восстановления юношеской экспрессии, как было предложено в недавнем отчете с использованием только SOK [11]. Несколько попыток также продемонстрировали достаточность подмножеств факторов Яманака для генерации iPSC [38, 39, 40, 41], но остается неизвестным, проявляют ли подмножества подобные транскрипционные эффекты только после короткой временной индукции. Как полная SOKM, так и уменьшенная комбинация факторов SOK являются онкогенными, что мотивирует поиск альтернативных стратегий перепрограммирования для восстановления молодой экспрессии генов [18, 42].

Здесь мы исследовали эффекты всех возможных наборов факторов Яманака, используя настраиваемую объединенную систему скрининга (рис. 3A). Наша система вдохновлена ​​другими объединенными системами скрининга и отслеживания [43, 44, 45, 46] и кодирует индуцируемый тетрациклином фактор перепрограммирования вместе с конститутивно выраженным штрих-кодом на отдельном лентивирусе. Мы ввели эти векторы в объединенном формате в двух независимых экспериментах на молодых и старых MSC и выполнили 3-дневный пульс / 3-дневный чейз. Выраженные лентивирусные штрих-коды позволили нам демультиплексировать уникальную комбинацию лентивирусов, инфицирующих каждую клетку in silico (рис. 3A, B; методы). Мы подтвердили точность демультиплексирования путем сравнения с подходом ортогонального демультиплексирования (Рис. S9, Методы).

Рисунок 3: Объединенный скрининг показывает достаточность подмножеств факторов Яманака и разделение между омоложением и подавлением идентичности.(A) Схема объединенных скрининговых экспериментов с факторами Яманака. Молодые и старые MSC трансдуцировали лентивирусами, каждый из которых нес один индуцибельный фактор Яманака с выраженными штрих-кодами (внизу). Перепрограммирование индуцировали для 3-дневного пульса / 3-дневного чейза (n = 5 животных на возраст в двух независимых экспериментах). Клетки были профилированы с помощью отдельно-клеточной РНК-seq, и уникальные комбинации факторов Яманака были демультиплексированы in silico на основе выраженных штрих-кодов. (B) Клетки из объединенного скрининга, встроенные с использованием scNym, спроецированные с помощью UMAP и помеченные обнаруженными факторами перепрограммирования (10000+ клеток). (C) Плотность клеток, нарушенных различным количеством факторов перепрограммирования при внедрении UMAP. Комбинации более высокого порядка показывают больший сдвиг транскрипции по сравнению с контрольными клетками. (D) Гены-маркеры MSC (вверху) уменьшаются, а гены-маркеры перепрограммирования (в центре) увеличиваются по мере увеличения комбинаторной сложности (количества уникальных факторов). Гены старения (внизу) также кажутся ближе к юношескому уровню с более сложными искажениями. (E) Матрица сходства между различными комбинациями факторов Яманака, извлеченными из модели классификации возмущений клеток. Сходство вычислялось как корреляция вероятностей предсказания по ячейкам для каждой пары комбинаций. Возмущения низкой сложности и контрольные (NT: необработанные) клетки подобны, в то время как комбинации триплетов очень похожи друг на друга и полный набор факторов Яманака (SOKM). (F) Показатели идентичности мезенхимальных клеток, полученные на основе моделей scNym, и оценки набора генов старения в старых клетках, перепрограммированных с использованием различных комбинаций факторов (средние значения и 95% доверительный интервал). Все комбинации факторов Яманаки, кроме двух, значительно снижали как показатель идентичности мезенхимальных клеток, так и показатель возраста по сравнению со старыми контрольными клетками (NT) (тесты Вальда, p 0,01). Однако возрастные баллы и баллы идентичности не были хорошо коррелированы, предполагая, что подавление идентичности клеток и омоложение не связаны тесно (Спирмен ρ = -0,35, p 0,20). 

Мы извлекли 100 клеток для всех комбинаций факторов Яманака (рис. 3B, C). Чтобы подтвердить эффективность нашей объединенной системы скрининга, мы исследовали влияние каждой комбинации на гены-маркеры перепрограммирования. Мы обнаружили, что гены-маркеры мезенхимы уменьшались в зависимости от комбинаторной сложности (количества уникальных факторов), в то время как гены-маркеры перепрограммирования увеличивались (Рис. 3D). Этот результат согласуется с известной биологией факторов Яманака, где комбинации более высокого порядка более эффективны при перепрограммировании [3]. Затем мы хотели определить, вызывают ли разные комбинации факторов Яманака уникальные эффекты, или каждая комбинация вызывает схожие программы экспрессии генов, различающиеся больше по величине, чем по направлению. Мы исследовали этот вопрос, обучая современную модель классификации идентичности клеток, чтобы различать клетки, возмущенные каждой уникальной комбинацией факторов Яманака (методов) [31]. Комбинации, которые очень похожи, могут быть часто перепутаны моделью, в то время как уникальные комбинации могут быть легко различимы. Чтобы проанализировать наш обученный классификатор, мы извлекли вероятности предсказания для комбинаций для каждой ячейки, а затем вычислили корреляцию этих вероятностей для каждой пары комбинаций в качестве метрики сходства. Мы обнаружили, что возмущения одинаковой комбинаторной сложности очень похожи, в то время как возмущения разной сложности легко различимы. Например, большинство комбинаций триплетов часто путали с полным набором факторов Яманака (рис. 3E). Мы также сравнили дифференциально экспрессируемые гены для каждой комбинации с использованием индекса Жаккара и векторов средней экспрессии с использованием косинусного сходства, получив аналогичные результаты (рис. S10A, B).

Большинство комбинаций факторов Яманака с аналогичной сложностью, таким образом, имеют сходные транскрипционные эффекты при индукции в течение короткого периода времени. Сходство среди комбинаций более высокого порядка может быть связано с активацией общих эффекторов в сети плюрипотентности, даже при отсутствии недостающих факторов, что согласуется с предыдущими сообщениями [38, 39, 40, 41]. Также вероятно, что эндогенная копия отсутствующего фактора активируется остающимся фактором, поскольку факторы Яманака могут активировать друг друга [30] (рис. S10C). Мы не наблюдали значительного повышения регуляции недостающих факторов в наших данных (q 0,1, дифференциальное выражение Монте-Карло), но мы не можем исключить возможность временной активации. Взятые вместе, наши результаты показывают, что для восстановления молодой экспрессии генов не требуется какой-либо один фактор Яманака.

Подмножества факторов Яманака вызывают и омоложение, и подавление идентичности клеток, но в разных пропорциях

Мы задавались вопросом, были ли подавление идентичности клеток и восстановление экспрессии молодых генов сильно связанными при различных комбинациях факторов, так что более сильное восстановление экспрессии молодых генов было бы предсказанием более подавленной программы идентичности. Для исследования мы оценили программу идентификации мезенхимальных клеток с использованием классификатора идентичности клеток и активность набора генов старения, извлеченного из наших экспериментов по MSC клеткам из нашего скрининг- эксперимента [31] (методы). Мы обнаружили, что все комбинации факторов Яманака подавляли программу идентификации клеток и снижали оценку старения (рис. 3). Снижение оценки старения было значительным для всех программ, кроме двух с меньшим количеством ячеек (SOK, OKM; тесты Вальда, p 0,05).

Однако подавление оценки мезенхимальной идентичности и снижение оценки старения не были достоверно коррелированы (Спирмен ρ = -0,35, p 0,20). Этот результат был воспроизведен, когда мы рассматривали каждую из двух независимых экспериментальных партий из нашего скрина отдельно (минимальное q 0,12, максимальное ρ = - 0,1 корреляция Спирмена). Некоторые комбинации снижали оценку старения примерно до той же степени, что и полный набор факторов Яманака, при этом подавляя мезенхимальную идентичность значительно меньше (тест Вальда, p 0,05). Например, комбинация SO, не содержащая онкогенов, имела такое же снижение оценки старения, как и SOKM, но подавляла идентичность мезенхимальных клеток на 54% меньше, чем полный набор. Мы повторили эти эксперименты в меньшем масштабе на адипогенных клетках и получили качественно аналогичные результаты (рис. S11). Этот результат предполагает, что подавление идентичности клеток и восстановление молодой экспрессии генов могут быть разделены. Таким образом, возможно разработать стратегии перепрограммирования, которые восстанавливают юношескую экспрессию, сводя к минимуму риски подавления соматической идентичности.

Временное мультипотентное перепрограммирование улучшает миогенез в старых клетках

Наши результаты с факторами Яманака предполагают, что альтернативные стратегии перепрограммирования могут также восстановить молодую экспрессию. Мы задались вопросом, может ли быть эффективным временное перепрограммирование с мультипотентными факторами перепрограммирования. Чтобы проверить эту гипотезу, мы обратились к системе мультипотентного репрограммирования (в отличие от плюрипотентной системы) в миогенных клетках, по аналогии с регенерацией конечностей у urodele amphibian с использованием фактора транскрипции Msx1. Msx1 / 2, как известно, дедифференцирует миоциты до мультипотентного состояния и имеет задокументированную роль в регенерации пальцев и конечностей [47, 48, 49]. Мы выполнили 3-дневный пульс / 3-4-дневный чейз  экспрессии Msx1 с использованием доксициклин-индуцируемой лентивирусной системы в старых миогенных клетках in vitro, а затем профилировали клетки с помощью отдельно-клеточной RNA-seq в двух независимых экспериментах (рис. 4A). Как и в наших экспериментах по плюрипотентному перепрограммированию, мы отсортировали трансген-положительные и отрицательные клетки на основе экспрессии репортера, чтобы захватить контроль и перепрограммировать профили мРНК (рис. 4B, методы).

Рисунок 4: Импульсное перепрограммирование Msx1 увеличивает экспрессию миогенных генов в старых миогенных клетках.(A) Схема экспериментов мультипотентного репрограммирования со старыми миогенными клетками, выделенными от (n = 2 и n = 3 животных). (B) Интегрированные профили клеток из двух независимых экспериментов (метки, внизу справа), спроецированные с помощью UMAP. Псевдовременной анализ (слева) обеспечивает количественную оценку состояния миогенной дифференцировки для каждой клетки, подтвержденную анализом маркерного гена (вверху справа). (C) Временное мультипотентное перепрограммирование сдвинуло клетки в значительно более дифференцированное состояние в обоих экспериментах (суммы рангов Вилкоксона, p 0,05). Точно так же временное перепрограммирование значительно снижает сигнатуру транскрипционного старения, извлеченную из предыдущего исследования [23] (среднее ± SEM; t-тест, p 0,01, нормализовано в экспериментах). (D) Миогенные маркерные гены для компонентов саркомера были обогащены временным мультипотентным перепрограммированием в обоих экспериментах (нормализовано внутри экспериментов, q 0,1, Монте-Карло). 

Мы выделили миогенные клетки как в прогкниторном (Pax7 +), так и в дифференцированном состоянии (Myog +). Это ожидаемо, потому что наша система культивирования in vitro обеспечивает стимул дифференцировки [50] (рис. 4B). Ранее сообщалось, что старые миогенные клетки не дифференцируются в зрелые миоциты так же эффективно, как молодые клетки [51, 23]. Мы обнаружили, что временно перепрограммированные старые клетки были более дифференцированными, чем старые контрольные клетки, на основании псевдотемпоральных распределений, экспрессии маркерных генов и анализа набора генов (рис. 4C, D; рис. S12D). Этот результат был устойчивым к независимому анализу каждого эксперимента (рис. S12A, B, C). Мы также измерили сигнатуру транскрипции старения, полученную в результате предыдущего исследования миогенной дифференцировки, и обнаружили, что временное перепрограммирование значительно снижает оценку старения (рис. 4C), методы, p 0,01) [23]. Сама оценка миогенного старения находится под сильным влиянием программы дифференциации, так что псевдовремя объясняет значительную вариацию в оценке старения (r2 = 0,58, p 0,0001 критерий Вальда). Эти результаты предполагают, что мультипотентное перепрограммирование с помощью Msx1 может частично восстанавливать экспрессию молодых генов в миогенных клетках, подобно факторам Яманака в адипоцитах.

ОБСУЖДЕНИЕ

Старение вызывает широкие изменения экспрессии генов в различных типах клеток млекопитающих, и эти изменения связывались со многими характерными признаками старения [52, 21, 53]. Эксперименты по перепрограммированию клеток показали, что молодые животные могут развиваться из взрослых клеток, а признаки старения могут быть стерты путем полного перепрограммирования до плюрипотентности [2, 3, 5]. Недавние сообщения также предположили, что временной экспрессии SOKM достаточно, чтобы обратить вспять признаки старения и улучшить функцию клеток [9, 10, 11, 12]. Однако было неясно, подавляют ли эти временные вмешательства по перепрограммированию идентичность соматических клеток, активируют ли программы плюрипотентности на поздних стадиях или могут ли альтернативные стратегии перепрограммирования восстановить экспрессию молодых генов.

Здесь мы исследовали эти вопросы, используя измерения экспрессии генов в отдельных клетках, чтобы зафиксировать фенотипическую траекторию временного перепрограммирования и оценить влияние альтернативных методов перепрограммирования. Мы обнаружили, что временное перепрограммирование подавляет идентичность соматических клеток и активирует программы плюрипотентности (рис. 2), вопреки некоторым предыдущим отчетам [10, 11], но согласуется с экспериментами по перепрограммированию iPSC (рис. S7) и исследованиями по отслеживанию клеточных линий при временной экспрессии SOKM. [15]. Делая вывод о скорости РНК [34, 35] и применяя численные инструменты из динамических систем [37], мы также обнаружили, что временно перепрограммированные клетки возвращаются к своим исходным состояниям экспрессии генов после прохождения через промежуточное состояние (Рис. 2). Таким образом, наши профили отдельных клеток выявили временные состояния клеток, которые, вероятно, были замаскированы в предыдущих объемных измерениях, и поддерживают модель, в которой временное перепрограммирование подавляет соматические идентичности, которые позже повторно приобретаются посредством дифференцировки. Для подтверждения этой гипотезы потребуются дальнейшие эксперименты по профилированию популяций отдельных клеток в различные моменты времени во время временного перепрограммирования.

Остается неизвестным, какие из факторов Яманака необходимы для восстановления молодого паттерна экспрессии генов, или какие подмножества могут проявлять отдельные эффекты во время временного перепрограммирования. Предыдущие исследования изучали только один набор факторов за раз, что не позволяло проводить точные сравнения для ответа на эти вопросы [9, 10, 11, 12]. Наши объединенные скрины всех возможных подмножеств факторов Яманака показали, что комбинации из 3-4 факторов Яманака имеют удивительно похожие эффекты, что позволяет предположить, что ни один из факторов не является обязательным для восстановления молодой экспрессии. Комбинации двух факторов Яманака также были более похожи на полный набор SOKM, чем на контроль или однофакторные возмущения, и все комбинации факторов перепрограммирования снижали оценку старческой экспрессии генов (рис. 3). Наши данные демонстрируют, что не требуется единого фактора плюрипотентности, чтобы замаскировать признаки старения, и предполагает, что стратегии перепрограммирования без онкогенов также могут восстанавливать молодую экспрессию генов. Наши эксперименты по мультипотентному перепрограммированию миогенных клеток дополнительно подтверждают это предположение, указывая на то, что молодая экспрессия генов может быть восстановлена ​​даже без активации факторов плюрипотентности (Рис. 4).

Восстановление молодой экспрессии генов может улучшить функцию тканей, подразумевая, что временное перепрограммирование может иметь терапевтический эффект. Однако хорошо известно, что плюрипотентное перепрограммирование является онкогенным процессом [18], даже когда Myc исключен из набора перепрограммирования [42]. Хотя сообщалось, что на основании массовых измерений временное перепрограммирование не подавляет идентичность соматических клеток [9, 10, 11], наши результаты для отдельных клеток показывают, что идентичность соматических клеток подавляется, а GRN на поздней стадии активируются в переходном клеточном состоянии. в нескольких типах клеток (рис. 2). Это повышает вероятность того, что даже временное перепрограммирование может быть онкогенным. Поэтому желательно выявить альтернативные стратегии перепрограммирования для восстановления молодой экспрессии генов с более низким неопластическим риском. С этой целью мы показали, что временное перепрограммирование с различными подмножествами факторов Яманака вызывает транскрипционные эффекты очень сходные с полным набором, и что отдельная мультипотентная система перепрограммирования может обеспечивать молодую экспрессию. Эти результаты указывают на возможность разделить омолаживающие и индуцирующие плюрипотентность эффекты временного перепрограммирования и служат ресурсом для дальнейшего исследования эффектов временного перепрограммирования  старых клеток.

МЕТОДЫ

Животные

Мы выделили первичные клетки из подкожной жировой ткани (паховая подушечка) и мышц конечностей молодых (2-4 месяца) и старых (20-30 месяцев) самцов мышей C57Bl / 6. Мыши были заказаны в лабораториях Джексона и выдержаны в Calico Life Sciences, LLC. Молодым животным давали возможность акклиматизироваться в течение не менее 3 недель перед экспериментом. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Calico, аккредитованным AAALAC органом. Мы изолировали клетки от двух животных каждого возраста для экспериментов по перепрограммированию SOKM адипоцитов (старые животные, 28 месяцев) и трех животных каждого возраста для экспериментов SOKM мезенхимальных стволовых клеток (старые животные, 23 месяца). каждого возраста для одного независимого объединенного скринингового эксперимента MSC и от двух животных каждого возраста во втором независимом эксперименте (старые животные, возраст 28 месяцев). Мы выделили адипогенные клетки от двух животных каждого возраста в одном объединенном скрининговом эксперименте на адипогенные свойства (старые животные, возраст 28 месяцев) и от трех животных каждого возраста во втором эксперименте (старые животные, возраст 30 месяцев). Для экспериментов с миогенными клетками мы изолировали клетки от двух старых животных (28 месяцев) для первого эксперимента и трех старых животных (30 месяцев) для второго эксперимента.

Изоляция клеток

Мы изолировали пре-адипоцитарные клетки из подкожной жировой ткани, рассекая ткань ножницами на маленькие (1-2 мм) кусочки и выполняя расщепление 0,1% (мас. / Об.) Коллагеназой II (Gibco) в среде DMEM при 37 ° C в течение 1 часа. Суспензии жировых клеток промывают полной средой (10% FBS, DMEM) и инкубируют в 6-луночном планшете в течение ночи , одна лунка на животное. Мы выделили мезенхимальные стволовые клетки из мышечной ткани конечностей, разрезая мышцу на мелкие кусочки ножницами и выполнив две ферментативных варки. Сначала мы варили 0,2% (мас. / Об.) Коллагеназы II в среде DMEM в течение 90 минут, затем промывали клеточные суспензии в буферной воде для варки (F10, 10% лошадиная сыворотка) и проводили вторую инкубацию в 0,4% (мас. / Об.) Диспазе II. (Gibco) на один час. Суспензии обработанных мышечных клеток фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм, затем через фильтр для клеток 40 мкм и окрашивали антителами, конъюгированными с флуорофором (см. Таблицу S1). Мы отсортировали мезенхимальные стволовые клетки как CD31-, CD45-, PI-, Sca1 + с помощью FACS. МСК помещали в одну лунку каждого 6-луночного планшета для каждого животного и инкубировали в течение 24 часов.

Мы выделили миогенные клетки, выполнив такое же расщепление, которое описано для MSC на мышечной ткани конечностей. После получения суспензий единичных клеток мы выполнили процедуру предварительного посева, инкубируя клетки в лунках, покрытых ECM, полученных от саркомы, в течение 10 минут, затем немедленно перенесли суспензии клеток в новые лунки, покрытые ECM. Этот этап предварительного посева захватывает большинство прикрепленных немиогенных клеток в суспензии и позволяет захватить популяцию миогенных клеток высокой чистоты в последних лунках. Клетки инкубировали в течение ночи в миогенной среде для роста (F10, 20% FBS, 1% Pen / Strep; Gibco, с добавлением 5 нг / мл rFGF2; R&D Systems).

Культура клеток

Адипогенные клетки перед трансдукцией пассировали лентивирусными векторами. Клетки диссоциировали реагентом TrypLE (Gibco) и высевали по 100000 клеток / лунку в 6-луночный планшет, используя отдельные лунки для каждого животного, и трансдуцировали после инкубации в течение ночи. MSC, полученные из мышц, один раз пассировали перед трансдукцией с использованием Try-pLE. МСК высевали из расчета 50 000 клеток / лунку в 6-луночный планшет для экспериментов по полицистронному перепрограммированию и 25 000 клеток / лунку для объединенных скрининговых экспериментов. Для групповых скрининговых экспериментов МСК высевали из расчета 7500 клеток / лунку в 24-луночный планшет, по одному планшету на животное. Для объединенного скрининга адипогенных клеток клетки высевали из расчета 100000 клеток / лунку в 6-луночные планшеты. Миогенные клетки размножали в течение 5-7 дней перед трансдукцией лентивирусов в миогенной ростовой среде и пассировали для посева при 100000 клеток / лунку в 6-луночных планшетах для трансдукции. Миогенные клетки пассировали с буфером для диссоциации клеток (Gibco).

Лентивирусное клонирование и производство

Для экспериментов по полицистронному перепрограммированию мы синтезировали кДНК мышей для Pou5f1, Klf4, Myc и Sox2. Мы удалили стоп-кодоны из всех кДНК, кроме Sox2, и конкатенированных кДНК в полицистрон, используя 2A-пептидные последовательности для конечной открытой рамки считывания O-P2A-K-T2A-M-E2A-S. Мы вставили этот полицистрон OKMS в лентивирусный вектор-переносчик 3-го поколения, фланкированный индуцируемым тетрациклином 5 ’TRE3G-промотором и 3’ ответным элементом wood-chuck промотора. Мы также включили промотор цитомегловируса (CMV), управляемый репортерным транскриптом mCherry 3 ’из WPRE до 5’ конца лентивирусного повтора (LTR). Мы называем этот вектор LTV-Y4TF. Для объединенных скрининговых экспериментов мы синтезировали кДНК для факторов Яманака, за которыми следует eGFP, управляемый коротким промотором EF-1 альфа (EFS) с уникальным 8-мерным штрих-кодом в 3 'UTR, за которым следует внутренний сигнал полиА SV40 в геноме лентивируса. . Мы клонировали каждый трансген фактора Яманака в лентивирусные векторы для переноса с 5 ’промотором TRE3G для управления экспрессией фактора Яманака. Эти разработки были вдохновлены системой отслеживания клонов CellTag [46] и позволяют нам обнаруживать набор факторов Yamanaka, которые трансдуцировали данную клетку на основе восстановления уникальных штрих-кодов, даже несмотря на то, что трансгены фактора Yamanaka экспрессируются только временно. Мы называем эти векторы LTV-S-BC, LTV-O-BC, LTV-K-BC и LTV-M-BC, где BC обозначает 3 ’выраженный штрих-код.

Для экспериментов по мультипотентному перепрограммированию миогенных клеток мы клонировали кДНК Msx1 с разделяемой меткой mCherry Msx1-T2A-mCherry в лентивирусный вектор, управляемый TRE3G, с репортером eGFP, управляемым 3 ’CMV. Мы называем этот вектор LTV-Msx1. Мы использовали три разных лентивирусных вектора-трансактиватора тетрациклина, все несли один и тот же аллель трансактиватора тетрациклина Tet3G, фланкированный разными флуоресцентными репортерами, чтобы обеспечить совместимость с разными векторами перепрограммирования. Для полицистронного перепрограммирования в мышечных МСК мы использовали управляемый ЦМВ вектор Tet3G-T2A-mCerulean (LTV-Tet3G-mCerulean; адаптированный из VectorBuilder cat. VB180123-1018bxq сборкой Гибсона). Для полицистронного перепрограммирования в адипогенных клетках мы использовали вектор, содержащий управляемую EF1a ORF Tet3G, за которой следует репортер eGFP-T2A-PuromycinR, управляемый CMV (LTV-Tet3G-eGFP; VectorBuilder cat. VB900088-2774nkq). Для объединенного скрининга мы использовали вектор, несущий Tet3G, управляемый CMV, за которым следует репортер mCherry, управляемый 3 ’WPRE и CMV (LTV-Tet3G-mCherry; VectorBuilder cat. VB900088-2776tfj).

Мы упаковали лентивирус путем трансфекции клеток HEK293T упаковывающими лентивирусными плазмидами LV-MAX (Gibco) и представляющим интерес вектором переноса, содержащим LTR, с использованием липофектамина 3000 (Gibco). Мы собирали супернатант из вирусных упаковывающих клеток через 24 и 48 часов после трансфекции, очищали супернатант центрифугированием, фильтровали супернатант с помощью фильтров 0,45 мкм и концентрировали очищенный супернатант с использованием реагента для осаждения PEG-it (System-Bio). Лентивирусные конструкции титровали путем трансдукции клеток HEK293T серийными разведениями вируса и измерения частоты экспрессии флуоресцентного репортера через 72 часа. Мы также приготовили лентивирусные частицы через коммерческих поставщиков, которые используют аналогичные протоколы.

Лентивирусная трансдукция

Мы проводили лентивирусные трансдукции с использованием стандартного метода спинфекции для всех типов клеток. Для адипогенных клеток мы смешали соответствующий титр вируса с полной средой для выращивания с добавлением [8 мкг / мл] полибрена и заменили среду для выращивания вирусной суспензией. Мы центрифугировали клетки в планшетах с лунками при 2000 x g в течение 1 часа и инкубировали в течение ночи перед заменой среды для роста. Для МСК мы аналогичным образом добавили вирусную суспензию, центрифугировали клетки при 2000 x g в течение 1 часа и инкубировали клетки в течение ночи перед заменой среды. Для миогенных клеток мы добавили вирусную суспензию и трансдуцировали путем спинфекции в течение одного часа при 1500 x g с полибреновым адъювантом ([8 мкг / мл] в среде).

Переходное полицистронное перепрограммирование

Мы выполнили временное перепрограммирование в адипогенных клетках с использованием LTV-Y4TF и LTV-Tet3G-eGFP. Мы трансдуцировали при MOI 30 в ростовой среде, содержащей полибрен ([8 мкг / мл]), путем центрифугирования в течение 1 часа при 2000 × g. Мы заменили питательную среду после инкубации в течение ночи и начали трехдневный пульс Dox ([4 мкг / мл]), меняя среду каждые 24 часа, после чего следовал трехдневный чейз. Мы выполнили тот же протокол для мышечных МСК с использованием LTV-Y4Tf и LTV-Tet3G-mCerulean каждый при MOI 10. Для мышечных МСК мы также включили контрольную группу, трансдуцированную вирусом, но никогда не подвергавшуюся воздействию Dox. После периода чейза клетки были диссоциированы, и мы отсортировали клетки, экспрессирующие оба репортера LTV (LTV-Y4TF: mCherry, LTV-Tet3G: eGFP или mCerulean), против всех других клеток с помощью FACS. Эта сортировка позволила нам обогатить трансдуцированными клетками и обработанными профилем (положительный двойной трансген) и необработанными (отсутствие хотя бы одного трансгена) в отдельных клетках из одной и той же лунки, что служило контролем in situ.

Скрининг подмножеств факторов Яманака

Мы провели скрининг подмножеств фактора Яманака в двух различных экспериментах на МСК. В первом эксперименте мы высевали клетки в 24-луночные планшеты и доставляли каждую комбинацию факторов Яманака в одну лунку планшета с высоким MOI (MOI = 8) для каждого вируса. Мы доставили вирус-трансактиватор тетрациклина (LTV-CMVTet3G-CMVmCherry) во все лунки (MOI = 8). Перед секвенированием мы пометили сложность каждого возмущения (например, количество уникальных факторов) уникальным олигонуклеотидом, модифицированным холестерином, для сравнения с нашим демультиплексированием in silico. Во втором эксперименте мы засевали клетки в 6-луночные планшеты и доставили все факторы Яманака в пуле в каждую лунку. Мы трансдуцировали по одной лунке на животное как с низким, так и с умеренным значением MOI (MOI = 3, 6) и объединяли клетки перед секвенированием. Два MOI использовались для увеличения представления более сложных возмущений. В обоих экспериментах мы пульсировали факторы Яманака, вводя доксициклин [4 мкг / мл] в течение трех дней, и гоняли в течение 3 дней. Мы аналогичным образом провели объединенный скрининг в двух различных экспериментах на адипогенные клетки. В первом эксперименте мы выделили клетки от двух молодых и двух старых животных и трансдуцировали с помощью MOI 8. Во втором мы выделили клетки от трех молодых и трех старых (30 месяцев) животных и проанализировали с помощью MOI 8. Были выполнены адипогенные скрининга. с 100 000 клеток / лунку в 6-луночном формате.

Временное мультипотентное перепрограммирование в миогенных клетках

Мы провели временное репрограммирование с Msx1 в миогенных клетках в двух независимых экспериментах. В обоих экспериментах мы высевали 100000 миогенных клеток на лунку в 6-луночный планшет в миогенную среду для роста. Мы трансдуцировали клетки с MOI 15 с помощью LTV-Msx1 и LTV-Tet3G-mCherry. Мы инкубировали клетки в течение 12 часов, затем заменили вирусную суспензию свежей средой для выращивания, содержащей [4 мкг / мл] Dox. Мы ежедневно в течение трех дней заменяли носители на Dox, затем начали период чейза, когда использовались носители без Dox. Мы использовали трехдневный чейз для первого эксперимента и четырехдневный чейз для второго. Мы отсортировали клетки, экспрессирующие флуоресцентные репортеры обоих трансгенов против других клеток, с помощью FACS. Эта сортировка позволила нам обогатить трансдуцированными клетками и обработанными профилем (положительный двойной трансген) и необработанными (отсутствие хотя бы одного трансгена) в отдельных клетках из одной и той же лунки, что служило контролем in situ.

Отдельноклеточное секвенирование РНК

Мы выполнили хеширование клеток с олигонуклеотидами, модифицированными холестерином (CMO), чтобы пометить клетки отдельных животных уникальными штрих-кодами. Мы использовали уникальную группу из 1-2 CMO (интегрированных ДНК-технологий) для клеток от каждого животного и помеченных клеток в соответствии с протоколом MULTI-seq [54]. Библиотеки последовательностей РНК одиночных клеток получали с использованием химии экспрессии генов одиночных клеток NextGEM v3.1 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния). Клетки эмульгировали с использованием контроллера Chromium (10x Genomics), а затем готовили библиотеки в соответствии с протоколом набора библиотек. Мы запускали молодые и старые клетки на отдельных дорожках прибора 10x для всех экспериментов, чтобы обеспечить высочайшую точность демультиплексирования образцов. Для всех экспериментов, за исключением объединенных скринингов, мы дополнительно запускали трансген-положительные клетки, несущие как вектор перепрограммирования, так и тетрациклин-трансактиватор, и трансген-отрицательные клетки (без хотя бы одного вектора) на отдельных дорожках. Мы добавили аддитивный праймер MULTI-seq на этапе амплификации кДНК, чтобы обеспечить амплификацию штрих-кода CMO, как описано в протоколе MULTI-seq. Для экспериментов по миогенному перепрограммированию мы объединили миогенные клетки с очень разными типами клеток, подготовленными для несвязанных экспериментов, в одной и той же полосе и экстрагировали миогенные клетки in silico для анализа. Мы также объединили миогенные клетки, полученные от разных животных, без штрих-кодирования CMO, чтобы избежать потери клеток для этого редкого типа клеток.

Выравнивание чтения и демультиплексирование клеток

Мы псевдо-выровняли чтения в эталонный геном mm10 с помощью «kallisto» и выполнили демультиплексирование штрих-кода клеток и агрегацию считывания UMI с помощью «kallisto | bus-tools »[55, 56]. Для экспериментов с трансгенными конструкциями мы модифицировали ссылку mm10, чтобы включить лентивирусные геномы в качестве дополнительных хромосом в эталонный геном. Это позволило нам обнаружить присутствие трансгенных транскриптов в наших данных секвенирования. Мы назначили чтение библиотеки MULTI-seq штрих-кодам клеток с помощью «воздушного змея» [57]. Для объединенных скрининговых экспериментов мы дополнительно количественно определили количество штрих-кодов лентивирусного трансгена в каждой клетке с помощью «воздушного змея».

Шумоподавление профиля мРНК, вывод скрытых переменных и интеграция данных

Мы подавили шумы в избыточных профилях мРНК, используя модели scVI [20] с 64 латентными переменными. Мы подбираем модели scVI для 1000 эпох, используя раннюю остановку, чтобы минимизировать нижнюю границу доказательств (ELBO). Для объединенных скрининговых экспериментов MSC мы интегрировали наши объединенные и объединенные эксперименты по трансдукции, вводя пакетные коварианты в модель scVI. Точно так же мы использовали периодические инъекции ковариант для интеграции независимых адипогенных объединенных скрининговых экспериментов и экспериментов по миогенному мультипотентному репрограммированию. Для последнего приложения мы уменьшили размер скрытого пространства до 32 переменных, чтобы избежать переобучения меньшему набору данных. Для миогенных экспериментов мы дополнительно использовали интеграцию «гармонии» при PCA-разложении латентного пространства scVI для учета пакетных эффектов в независимых экспериментах [58]. Чтобы построить общее латентное пространство между адипогенными клетками и МСК, мы приспособили модель scVI к обеим популяциям клеток одновременно. Для всех экспериментов мы построили граф ближайших соседей в латентном пространстве scVI и спроецировали этот граф в двух измерениях для визуализации с помощью UMAP.

Демультиплексирование MULTI-seq

Мы использовали подход «hashsolo» для демультиплексирования счетчиков чтения MULTI-seq как в адипогенных, так и в MSC экспериментах с предварительным распределением [0,02, 0,94, 0,04] ​​для отрицательных, синглетных и дублетных соответственно [59]. Мы вручную проверили классификации «хеш-соло» путем кластеризации профилей ячеек с использованием счетчиков CMO. При необходимости мы скорректировали метки кластера на основе ручной проверки. Мы использовали только вызовы достоверной классификации для анализа конкретных животных.

Объемная последовательность РНК молодых и старых MSC

Мы выполнили объемную последовательность РНК на молодых и старых MSC в трех независимых экспериментах. Клетки собирали у трех молодых (3-4 месяца) и трех старых (20-24 месяцев) животных в каждом эксперименте. В первом и втором эксперименте свежевыделенные клетки культивировали в течение 11-14 дней перед сбором РНК. В третьем эксперименте клетки из второго эксперимента со свежими клетками криоконсервировали в замораживающей среде для восстановления культур клеток (Gibco), затем размораживали и культивировали в течение 7 дней до сбора РНК. РНК выделяли из всех клеток, используя набор Zymo Quick RNA (Zymo Research), и библиотеки РНК-seq получали с помощью набора NEB-Next Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (New England Biolabs). Библиотеки секвенировали на Illumina NovaSeq. Мы псевдо-выровнены чтения с помощью kallisto [55] и количественно оценили дифференциальное выражение с помощью sleuth [60]. Мы извлекли сигнатуру гена старения, выбрав гены, которые изменялись с возрастом ниже свободного порога FDR (q 0,4) как в экспериментах с свежевыделенными клетками, так и в экспериментах с криогенно консервированными клетками. Эта процедура дала сигнатуру 198 генов старения, которые мы использовали для оценки экспрессии генов старения в нашем эксперименте по перепрограммированию MSC SOKM.

Оценка вклада ковариат в общую вариабельность

Мы оценили вклад экспериментальных ковариат (возраст, обработка трансгена) в общую вариацию, наблюдаемую в наших экспериментах, с помощью дисперсионного анализа. Мы рассматривали латентное кодирование scVI как набор переменных отклика и подбирали линейные модели для каждой переменной вида zj ∼age + treatment + age: treatment, где zj - латентная переменная. Мы также оценили вклад животного происхождения для каждой клетки с использованием специфичных для животных меток, полученных в результате демультиплексирования MULTI-seq. Мы выполнили ANOVA, как указано выше, с метками, специфичными для животных, с использованием моделей формы zj ∼ возраст * лечение + животное, где «животное» - это метка, специфичная для каждой комбинации «возраст: обработка», потому что мы использовали комбинации «возраст: обработка» отдельно реакции на подготовку библиотеки. Мы включили «отрицательные» классификации из «hashsolo» в эту регрессию на случай, если сбой хеширования CMO зафиксировал структурированные вариации.

Дифференциальная экспрессия

Мы выполнили тестирование дифференциальной экспрессии по бинарным контрастам, оценив логарифмические распределения изменений для каждого гена с использованием приближений Монте-Карло из апостериорного распределения scVI [61]. Мы оценили коэффициент ложного обнаружения (FDR) дифференциальной экспрессии как долю выборок Монте-Карло, которые не показали логарифмических изменений выше минимального порога (| log2 a / b | ≥0,5). Чтобы проверить непрерывные ковариаты и эффекты взаимодействия типа клетки: перепрограммирование, мы использовали логистические / гауссовские модели препятствий, вдохновленные MAST [62] для отдельных генов, и логистические модели для оценок генной программы на единичном интервале [0, 1], как описано ранее [23] ]. Мы выполнили FDR-контроль для моделей MAST с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга [63]. Мы выполнили тестирование дифференциальной экспрессии на псевдовременных ковариатах, используя модели вида «Gene ∼Pseudotime». Мы протестировали тип клеток: взаимодействие перепрограммирования с моделями формы «Ген ∼ Возраст + Тип клетки + Обработка + Тип клетки: Обработка».

Анализ обогащения набора генов

Мы выполнили анализ обогащения для терминов генной онтологии с помощью Enrichr [64]. Мы выполнили ранговый анализ обогащения набора генов (GSEA), используя реализацию «быстрого GSEA» алгоритма GSEA [24] и наборы генов, извлеченные из MSigDB [65].

Обобщенное аддитивное моделирование экспрессии генов в псевдовремени

Мы подбираем обобщенные аддитивные модели (GAM), чтобы выразить отношения между генами или генными программами и непрерывные псевдовременные координаты. Мы подбираем гауссовские GAM в форме «Gene ∼ Pseudotime», используя шесть кубических сплайнов через структуру PyGAM [66]. Мы представляем тренды выражений за псевдовремя, используя среднее значение прогнозов GAM вместе с 95% доверительным интервалом.

Оценка степени старения в транскрипционном пространстве

Мы оценили величину старения как разницу между молодыми и старыми популяциями клеток. Мы оценили эту разницу между двумя популяциями, используя максимальное среднее расхождение (MMD), вычисленное на латентных переменных scVI. Скрытые переменные scVI фиксируют выразительное низкоразмерное представление экспрессии генов и поэтому полезны для этой задачи. Мы вычислили MMD в нашем ранее описанном пакете «scmmd» по серии случайных выборок начальной загрузки, чтобы гарантировать надежность [23]. Вкратце, мы отобрали n = 300 клеток из каждой популяции и вычислили MMD на каждой из 500 итераций. Мы выполнили эти сравнения MMD, чтобы сравнить молодые, необработанные клетки как со старыми, необработанными клетками, так и с старыми перепрограммированными клетками. Мы оценили значимость изменений в MMD с помощью теста Wilcoxon Rank Sum для итераций начальной загрузки.

Скоростной анализ РНК

Мы подсчитали оценочные доли сплайсированных и несращенных считываний для каждого транскрипта на основе сопоставления считываний с экзонами и интронами с использованием «kallisto | bustools »к эталонному геному mm10 из Ensembl [55, 56]. Мы оценили скорость РНК [34], используя стохастическую модель, реализованную в «scvelo» [35].

Псевдотемпоральный вывод траектории

Мы вывели псевдовременные траектории для адипогенных клеток и МСК с помощью «scvelo». Вкратце, мы построили граф ближайших соседей в пространстве вложения и взвешенные ребра в графе на основе направленности векторов скорости РНК, так что соседи на пути вектора скорости РНК получили более высокие вероятности перехода. Затем мы соединили эту матрицу с методом диффузионного псевдовременного вывода [67]. Мы вывели псевдовременные траектории миогенных клеток с помощью диффузионного псевдовременного анализа на графе ближайших соседей, построенном в пространстве компонентов диффузии. Мы выбрали корневые клетки из верхнего дециля экспрессии Snai2 (примитивного маркерного гена).

Фазовое моделирование в полях скоростей РНК

Мы выполнили фазовое моделирование в полях скоростей РНК, используя наш ранее описанный пакет «velodyn» [23]. И для адипогенных клеток, и для МСК мы инициализировали n = 1000 фазовых точек внутри временно перепрограммированной популяции клеток в положениях x0 и развили их положения на основе векторов скорости РНК их соседей для t = 500 временных шагов с размером шага η = 0,5. Мы использовали правило обновления 

где мы обновляем текущую позицию xt до новой позиции xt + 1, используя функцию обновления V (xt | θ, X), которая выводит вектор скорости vt из k-ближайших соседей с заданными параметрами (k, η). Мы параметризуем V как случайную функцию выборки из многомерного взвешенного гауссовского распределения ? (µ ∗, Σ ∗), где соседи взвешиваются на основе расстояния в пространстве вложения от точки запроса.

Возрастная классификация клеток

Мы обучили модели вариационных автоэнкодеров с полууправлением, используя структуру scANVI, чтобы различать возраст клеток [68]. Перед обучением модели мы разделяем наши данные на обучающий набор (80%) и тестовый набор (20%) со стратификацией. Мы обучили модели scANVI для 100 неконтролируемых эпох (только потеря реконструкции) и 300 частично контролируемых эпох (потеря реконструкции и классификации), используя 10% обучающего набора в качестве данных проверки для ранней остановки. Мы оценили производительность модели на основе точности классификаций в проведенном наборе тестов, невидимой во время обучения модели.

Встраивание возмущений факторами перепрограммирования с помощью scNym

Мы подбираем модели классификации идентичности клеток scNym, чтобы различать МСК, временно перепрограммированные с помощью различных подмножеств фактора Яманака [31]. Мы выделили сбалансированный обучающий набор из полных объединенных данных скрининга MSC путем извлечения n = 100 клеток на комбинацию факторов. Мы относились ко всем оставшимся ячейкам как к испытательному набору. Мы обучили модель scNym на обучающем наборе, используя nhidden = 128 скрытых единиц на слой, период терпения 30 эпох до ранней остановки, максимальное количество эпох 150 и настройки по умолчанию для всех остальных параметров.

Впоследствии мы предсказали комбинации факторов для всех клеток в объединенных скрининговых экспериментах MSC. Мы спроектировали активации встраивания scNym для визуализации с использованием UMAP. Мы вычислили корреляцию предсказаний scNym для каждой комбинации факторов, вычислив корреляции между столбцами матрицы вероятностей предсказанного класса scNym ŷCells × Combinations.

Оценка программ идентификации клеток с помощью scNym

Мы использовали модели scNym для оценки активности конкретных программ клеточной идентификации в временно перепрограммированных клетках. Мы подбираем модели противостояния с полууправлением, используя Tabula Muris в качестве обучающего набора и наши временно перепрограммированные ячейки в качестве целевого набора данных. Мы использовали аннотации «класса онтологии ячеек» в Tabula Muris в качестве меток классов. Мы подбираем модели до 200 эпох и использовали раннюю остановку на проверочном наборе, взятом из обучающих данных, чтобы выбрать наиболее эффективную модель. Мы подбираем отдельные модели для эксперимента по перепрограммированию адипогенных SOKM, эксперимента по перепрограммированию MSC SOKM и объединенного экрана MSC.

Мы использовали обученные модели как для получения встраивания, так и для прогнозирования идентичности клеток из обучающего набора Tabula Muris в наших временно перепрограммированных ячейках. Мы суммировали вероятность нескольких сходных идентичностей клеток, чтобы создать оценку «мезенхимальной идентичности» для каждой клетки (идентичности: «мезенхимальная стволовая клетка», «мезенхимальная клетка», «стромальная клетка»). Мы вычислили энтропию идентичности ячейки как энтропию Шеннона вектора вероятности идентичности ячейки, предсказанного scNym.

где k ∈ K - индексы классов, p - вектор единичной вероятности, а H (·) - функция энтропии.

Оценка экспрессии генов старения в объединенных скрининговых экспериментах

Чтобы сравнить влияние различных комбинаций факторов Яманака на особенности старения, мы разработали «Шкалу старения», основанную на генах, дифференциально экспрессируемых с возрастом в МСК. Сначала мы идентифицировали гены, которые значительно дифференциально экспрессировались (q 0,10) в одном и том же направлении в контрольных МСК как для нашего эксперимента по полицистронному перепрограммированию, так и для объединенных скринингов. Мы сделали пересечение этого набора с набором генов, которые показали значительное восстановление экспрессии генов молодости в любой из комбинаций фактора Яманака. Это дало набор из 228 генов старения, на которые влияет репрограммирование. Мы получили отдельные оценки AgeUp и AgeDown, используя стандартный метод оценки набора генов для генов с повышенной и пониженной регуляцией соответственно [69]. Затем мы взяли разницу между этими показателями как показатель старения: показатель старения = AgeUp -AgeDown. Мы использовали аналогичную процедуру для объединенных скрининговых экспериментов на адипогенные факторы, чтобы получить набор из 801 гена старения и соответствующий показатель старения. Чтобы количественно оценить влияние каждой комбинации на возрастную оценку, мы использовали линейную регрессию в форме: Оценка старения ∼ Комбинация + Возраст с использованием старых клеток для всех обработок и только контрольных (NT) молодых клеток в качестве данных наблюдений. Мы исключаем молодые обработанные клетки из регрессии, чтобы коэффициенты для каждой комбинации отражали влияние комбинации на старые клетки. Мы извлекли коэффициенты и их доверительные интервалы для сравнения между комбинациями (рис. 3F).

Оценка старческой экспрессии генов в экспериментах по миогенному мультипотентному перепрограммированию

Мы повторно проанализировали общедоступные профили последовательностей РНК одиночных клеток молодых (3 месяца) и старых (20 месяцев) миогенных клеток после дифференцировки in vitro для определения сигнатуры гена старения (GEO: GSE145256) [23]. Мы извлекли 329 генов, которые были изменены более чем в 2 раза между молодыми и старыми миогенными клетками с коэффициентом ложного обнаружения q 0,10 (тест Wilcoxon Rank Sum, контроль Benjamini-Hochberg FDR). Затем мы сгенерировали оценки AgeUp и AgeDown, как описано выше, чтобы построить оценку старения. Для наглядности мы перенесли оценку старения в процентильный интервал [3, 97].

Повторный анализ времени перепрограммирования ИПСК

Мы повторно проанализировали данные предыдущего исследования последовательности РНК одной клетки эмбрионального фибробласта мыши с целью перепрограммирования ИПСК (GEO: GSE122662) [27]. Мы обучили модель scVI шумоподавлению данных, изучению скрытых переменных и выполнению дифференциального выражения, как указано выше.

Повторный анализ старения жировой ткани Tabula Muris Senis

Мы повторно проанализировали данные исследования одноклеточной РНК Tabula Muris Senis старения мышей в жировой ткани (GEO: GSE149590) [21]. Мы нормализовали данные экспрессии с помощью логарифмической трансформации (CountsPerMillion + 1), выбрали сильно вариабельные гены и встроили клетки с помощью UMAP на графе ближайших соседей, полученном с помощью PCA. Мы выполнили дифференциальное выражение с двухвыборочным t-критерием, используя scanpy [70].

Вклад авторов

AR разработала и провела эксперименты по молекулярной биологии и внесла свой интеллектуальный вклад. CZ и JZS проводили эксперименты на животных. JP провел цитометрические эксперименты. TV провел массовые эксперименты с последовательностью РНК. Исследование под руководством Г.К. CK внес интеллектуальный вклад и отредактировал статью. JCK задумал исследование, спроектировал эксперименты, провел эксперименты с культурами клеток, молекулярной биологией, перепрограммированием и секвенированием РНК отдельных клеток, проанализировал данные, руководил исследованиями и написал статью.

Дополнительные рисунки

Рисунок S1: адипогенные клетки in vivo демонстрируют сходные черты старения с адипогенными клетками in vitro.(A) Адипогенные клетки из подкожной жировой ткани в Tabula Muris Senis [21], залитые UMAP, окрашены по возрасту. Молодые клетки (3 месяца, месяцы) и старые клетки (24 месяца) четко разделяются в пространстве транскрипции, аналогично нашим данным in vitro. (B) Экспрессия нескольких адипогенных генов ограничена молодыми клетками. (C) Многие адипогенные гены демонстрируют значительно сниженную экспрессию с возрастом, аналогично результатам in vitro (q 0,05, t-тест). (D) Анализ обогащения набора генов для генов, значительно изменившихся в возрасте от 3 месяцев (3 месяца) до 24 месяцев (24 месяца), показывает сильное подавление программ адипогенеза, окислительного фосфорилирования и развернутого белкового ответа (Hallmark MSigDB, q 0,01, точное определение Фишера). 

Рисунок S2: Возраст и эффекты перепрограммирования являются доминирующими источниками изменений в временно перепрограммированных клетках.(A) ANOVA приводит к временно перепрограммированным адипогенным клеткам, где оставшаяся вариация не объясняется показанными ковариатами. (B) ANOVA приводит к временно перепрограммированным МСК. В обоих типах клеток возраст и лечение перепрограммированием являются основными источниками объясненных вариаций, в то время как животное (хэш) является второстепенным фактором. 

Рисунок S3: Временное перепрограммирование в мышечных МСК ремоделирует экспрессию генов.(А) Схема эксперимента. MSC, полученные из мышц, трансдуцировали с помощью индуцируемой тетрациклином полицистронной кассеты фактора Яманака и временно перепрограммировали с помощью 3-дневного импульса Dox и 3-дневного Dox-чейза. (B) Репрограммированные клетки (Tg +) четко отделяются от контрольных клеток (Tg-) в латентном пространстве транскрипции, в то время как возраст является меньшим источником вариаций. (C) Профили отдельных клеток разрешают различные состояния клеток, вызванные перепрограммированием. (D) Временное перепрограммирование улучшает вызванное старением увеличение наборов генов фиброза и оценку генов старения, полученную в экспериментах с объемной последовательностью РНК. (E) Молодежная экспрессия генов восстанавливается в тысячах генов посредством временного перепрограммирования, несмотря на большую величину эффектов  перепрограммирования, ортогональных оси старения. (F) Временное перепрограммирование увеличивает максимальное среднее расхождение между молодыми контрольными клетками и старыми клетками, предполагая, что многие эффекты перепрограммирования ортогональны оси старения. 

Рисунок S4: Полу-контролируемые классификаторы старения демонстрируют сегрегацию МСК по возрасту в транскрипционном пространстве.(A) MSC, встроенные в скрытое пространство с использованием полууправляемой вариационной модели автокодера. Мы обучили вариационный автоэнкодер совместно реконструировать транскриптомы и классифицировать возраст клеток, изучая представление, которое разделяет молодые и старые клетки в латентном пространстве. (B) Ячейки из тестового набора, спроецированные в частично контролируемое скрытое пространство, окрашенное предсказаниями класса. Мы обнаружили, что предсказания возраста были точными на 93%, подтверждая, что особенности старения фиксируются на уровне транскрипции. 

Рисунок S5: Bulk RNA-seq показывает воспроизводимую транскрипционную сигнатуру старения в МСК.(A) Профили массовых последовательностей РНК молодых (Y) и старых (A) МСК, собранные в трех отдельных экспериментах. Показаны гены со значительными эффектами старения во всех трех экспериментах. Мы использовали эти наборы генов для получения «оценки старения» для нашего эксперимента по временному перепрограммированию (рис. S3D). «Свежие» образцы были приготовлены из свежевыделенных МСК после периода культивирования in vitro, в то время как образцы «Крио» были приготовлены после криоконсервации и последующего культивирования. (B) Анализ обогащения онтологии генов для наборов генов MSigDB Hallmark. Гены эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) сильно обогащены для возрастных изменений. Как воспалительные гены, так и сигнальный фактор фиброза TGF-β возрастают с возрастом. 

Рисунок S6: Идентичность клетки определяет эффекты временного перепрограммирования.(A) Кратковременно перепрограммированные адипогенные клетки и МСК из наших полицистронных экспериментов были встроены в совместное латентное пространство с scVI, чтобы обеспечить прямое сравнение размеров эффекта. (B) ANOVA показал, что взаимодействия типа клетки: перепрограммирование составляют примерно 11% от общей неостаточной вариации, объясняемой ковариатами. (C) Мы повторно вычислили величины старения по максимальному среднему расхождению для контрольных адипогенных клеток и МСК в суставном латентном пространстве, чтобы учесть прямое сравнение. Мы обнаружили, что степень старения была значительно выше в адипогенных клетках (p 0,01, критерий суммы рангов Вилкоксона). (D) Мы выполнили дифференциальную экспрессию, чтобы идентифицировать гены со значительными взаимодействиями типа клетки: перепрограммирование. Качественный анализ экспрессии генов в латентном пространстве выявляет изменения эффектов, специфичных для типов клеток, по траекториям репрограммирования. (E) Мы использовали анализ генной онтологии, чтобы исследовать наиболее значимые взаимодействия типа клетки: перепрограммирование. Наборы генов эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) и внеклеточного матрикса (ECM) были менее подавлены в адипогенных клетках после перепрограммирования (положительные коэффициенты взаимодействия Adipogenic: Reprogramming), тогда как наборы гликолитических генов были менее активированы (отрицательные коэффициенты взаимодействия). (F) Кластеризация набора генов со значимым типом клеток: взаимодействия при перепрограммировании выявляют заметные различия в величине эффекта перепрограммирования для разных типов клеток. Напротив, величина эффекта в зависимости от возраста в пределах одного и того же типа клеток довольно согласована. 

Рисунок S7: гены плюрипотентности активируются в подмножестве клеток в течение 2-4 дней после экспрессии OSKM в эмбриональных фибробластах мыши (MEF).(A) UMAP-проекция профилей мРНК отдельных клеток из MEF, подвергающихся перепрограммированию с использованием индуцируемого тетрациклином аллеля OSKM зародышевой линии [27]. Перепрограммирование вызывает новые состояния клеток всего через 2 дня, что согласуется с сильными эффектами, которые мы наблюдаем после короткого импульса OSKM. (B) Экспрессия маркеров плюрипотентности (Nanog, Rragd) и генов ответа на раннее репрограммирование (другие) в течение периода времени перепрограммирования MEF. Мы наблюдаем индукцию генов ответа на раннее перепрограммирование в соответствии с нашими данными временного перепрограммирования. Мы также наблюдаем активацию регулятора плюрипотентности Nanog в начале временного курса (день 2, 4), что согласуется с нашими временными результатами перепрограммирования. (C) Экспрессия плюрипотентности и ранних генов перепрограммирования через временной интервал перепрограммирования MEF. Nanog значительно усиливается только через 2 дня перепрограммирования (q 0,1, оценка логарифмического изменения Монте-Карло). 

Рисунок S8: Анализ генной регуляторной сети (GRN) показывает подавление GRN идентичности соматических клеток во время временного репрограммирования.Мы извлекли направленный граф GRN из базы данных TRRUST, связывая факторы транскрипции мышей с прямыми генами-мишенями [30]. Затем мы оценили активность GRN в временно перепрограммированных адипогенных клетках и МСК, используя подход интеграции на основе рангов, заимствованный из SCENIC [29]. (A) Адипогенные клетки, встроенные в транскрипционное пространство, полученное из оценок активности GRN. Показатели GRN точно отражают эффекты перепрограммирования и различия состояний клеток в контрольных популяциях. (B) баллы GRN в псевдовремя перепрограммирования (чем выше, тем больше перепрограммировано). Мы обнаружили, что GRN плюрипотентности (Sox2, Pou5f1) увеличиваются, как и ожидалось, при перепрограммировании, в то время как GRN с адипогенной идентичностью (Pparg, Parp1) подавляются (тест Вальда, биномиальный GLM, p 0,01). (C) GRN плюрипотентности (вверху) и GRN с адипогенной идентичностью (внизу), проецируемые в латентное пространство оценки GRN, четко различают контрольные и временно перепрограммированные клетки. (D) MSC, полученные из мышц, встроенные с использованием показателей активности GRN. Показатели GRN снова отражают изменения состояния клеток, вызванные временным перепрограммированием. (E) GRN плюрипотентности увеличиваются, как и ожидалось, с перепрограммированием в MSC, в то время как GRN мезенхимальной идентичности (Snai2, Parp1) подавляются (тест Вальда, биномиальный GLM, p 0,01). (F) Плюрипотентность (вверху) и мезенхимальная идентичность (внизу) оценки GRN в латентном пространстве GRN показывают явное обогащение для перепрограммированной и контрольной популяций соответственно. 

Рисунок S9: Маркировка MULTI-seq комбинаторной сложности и демультиплексирование на основе выраженного штрих-кода демонстрируют строгое соответствие(А) Схема эксперимента. Мы выполнили пилотный объединенный скрининг в формате массива и обозначили количество уникальных факторов в каждом состоянии лечения с помощью MULTI-seq. Затем мы сравнили метки, полученные с помощью MULTI-seq, с нашей системой выраженного штрих-кода (CellTag) для демультиплексирования комбинаторных возмущений. Присвоение меток MULTI-seq несовершенно, и выраженные штрих-коды могут не обнаруживать ошибок, поэтому мы не ожидаем идеального соответствия 1: 1. (B) Тепловая карта соответствия между метками сложности, полученными из MULTI-seq, и выраженными штрих-кодами для ячеек с достоверной меткой, полученной из MULTI-seq. Мы обнаружили, что ожидаемая сложность, основанная на штрих-кодах MULTI-seq, является доминирующим режимом для выраженных классификаций штрих-кодов. Мы ожидаем, что в нижнем треугольнике матрицы появятся элементы из-за (1) неудачных обнаружений штрих-кода или (2) ячеек, которые получили меньше целевого числа уникальных факторов в данном состоянии из-за стохастичности преобразования. Поэтому мы считаем все метки в нижней треугольной матрице точными. Очень мало ячеек выходит за пределы нижнего треугольника, вероятно, из-за неправильных вызовов штрих-кода MULTI-seq. (C) Соответствие меток, количественно оцененных по меткам условий лечения MULTI-seq (среднее + 95% ДИ). Все сложности показывают высокую степень соответствия (80% совпадений calls). 

Рисунок S10: Комбинации факторов Яманака более высокого порядка оказывают аналогичные транскрипционные эффекты.(A) Сравнение наборов дифференциально экспрессируемых генов (DEG) относительно контроля для каждого возмущения. Индекс Жаккара измеряет количество общих генов в двух наборах как долю от общего числа уникальных генов в обоих наборах. Подобно результатам, полученным с помощью нашего классификатора возмущений, мы обнаруживаем, что комбинации факторов Яманака с аналогичной сложностью вызывают аналогичные транскрипционные эффекты после кратковременного импульса. (B) Сравнение средних векторов экспрессии генов для каждой комбинации фактора Яманака (NT: необработанные контроли) с использованием косинусного сходства (положительные значения более похожи). Мы снова обнаружили, что комбинации более высокого порядка вызывают аналогичные транскрипционные эффекты. (C) Принудительно управляемая визуализация компоновки соединений в регуляторной сети гена плюрипотентности, извлеченной из базы данных TRRUST. Факторы Яманки выделены зеленым цветом. Все три подмножества факторов Яманака могут активировать четвертый фактор. (D) Сравнение интерферона (IFN), эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) и сигнатур генов KRAS в клетках с различным количеством уникальных факторов перепрограммирования. Наибольшие различия между комбинациями трех и двух факторов заключаются в более сильном подавлении программ IFN и EMT и более сильной активации программы передачи сигналов KRAS. (E) Обогащенный анализ онтологии генов с наборами генов MSigDB Hallmark подтверждает результаты на уровне генов в (D). (F) Программная активность EMT и IFNγ тесно коррелирована (r 0,9), что позволяет предположить, что они подавляются общим механизмом. (G) Программные мероприятия EMT и KRAS антикоррелированы (r - 0,6), что позволяет предположить, что эти эффекты также могут иметь общий механизм во время процесса перепрограммирования. 

Рисунок S11: Объединенный скрининг адипогенных клеток дает результаты, аналогичные скринингу на МСК.(A) Схема объединенных скрининговых экспериментов с фактором Яманака. Молодые и старые адипогенные клетки трансдуцировали лентивирусами, каждый из которых нес один индуцибельный фактор Яманака с выраженными штрих-кодами (внизу). Перепрограммирование индуцировали для 3-дневного пульса / 3-дневного преследования (n = 5 животных на возраст в двух независимых экспериментах). Клетки были профилированы с помощью одиночной клеточной РНК-seq, и уникальные комбинации факторов Яманака были демультиплексированы in silico на основе выраженных штрих-кодов. (B) Клетки из объединенного экрана, встроенные с использованием scNym, спроецированные с помощью UMAP и помеченные обнаруженными факторами перепрограммирования (9000+ клеток). (C) Плотность клеток, нарушенных различным количеством факторов перепрограммирования при внедрении UMAP. Комбинации более высокого порядка показывают больший сдвиг транскрипции по сравнению с контрольными клетками. (D) Адипогенные маркерные гены (вверху) уменьшаются, а маркерные гены репрограммирования (в центре) увеличиваются по мере увеличения комбинаторной сложности (количества уникальных факторов). Гены старения (нижний) также кажутся ближе к юношескому уровню с более сложными нарушениями. (E) Матрица сходства между различными комбинациями факторов Яманака, извлеченными из модели классификации возмущений клеток. Сходство классификатора менее драматично, чем в МСК, но наиболее сильное сходство снова наблюдается для комбинаций факторов Яманака более высокого порядка. (F) Показатели идентичности мезенхимальных клеток, полученные на основе моделей scNym, и оценки набора генов старения в старых клетках, перепрограммированных с помощью различных комбинаций факторов (средние значения ± 95% ДИ). Многие комбинации факторов Яманака значительно снижали как показатель идентичности мезенхимальных клеток, так и показатель возраста по сравнению со старыми контрольными клетками (NT) (тесты Вальда, p 0,05). Однако возрастные баллы и баллы идентичности не были хорошо коррелированы, предполагая, что подавление идентичности клеток и омоложение не тесно связаны (р = 0,19, р 0,48, Спирмен). 

Рисунок S12: Импульсное перепрограммирование с фактором мультипотентности Msx1 увеличивает миогенез в старых миогенных клетках.Старые миогенные клетки обрабатывали кратковременным импульсом Msx1 в двух отдельных экспериментах. Эксперименты были проанализированы независимо ниже. (A) Псевдоанализ (слева) и анализ маркерного гена (справа) показывают траекторию миогенной дифференцировки как в первом (n = 2 животных, возраст 28 месяцев), так и (B) во втором независимом эксперименте (n = 3 животных, возраст 30 месяцев). ). (C) Мы выполнили анализ псевдовременности независимо в каждом экспериментальном состоянии. Как и в нашем интегрированном анализе (рис. 4), временно перепрограммированные клетки были значительно более дифференцированными, чем контрольные в обоих экспериментах (критерий суммы рангов Вилкоксона, p 0,01). (D) Мы оценили активность набора генов Hallmark Myogenesis (MSigDB). Оба эксперимента показали значительное увеличение активности набора миогенных генов после обработки временным перепрограммированием (критерий суммы рангов Вилкоксона, p 0,01). 

 Дополнительные таблицы

Опубликовано: 23 мая 2021г.

Авторы:  Antoine Roux, Chunlian Zhang, Jonathan Paw, José Zavala-Solorio, Twaritha Vijay, Ganesh Kolumam, Cynthia Kenyon, Jacob C. Kimmel

Оригинальная статья: Partial reprogramming restores youthful gene expression through transient suppression of cell identity

Перевод Ник Сестрин

Событие омоложения во время раннего эмбриогенеза

Чтобы оценить эпигенетическую возрастную динамику во время эмбриогенеза, мы собрали доступные наборы данных о метилировании ДНК человека и мыши (Таблица 1) и оценили их различными часами эпигенетического старения (Таблица 2). Мы также разработали часы метилирования мульти-тканевой рибосомной ДНК (rDNAm) (рис. S1, S2). РДНК характеризуется большим количеством связанных с возрастом сайтов CpG, которые демонстрируют высокий охват последовательностей из-за множественности рДНК в геноме (35, 44). Новые часы способны предсказывать эпигенетический возраст RRBS (reduced representation bisulfite sequencing, бисульфитное секвенирование с уменьшенным представлением ), WGBS (полногеномное бисульфитное секвенирование) и даже псевдогрупповые образцы секвенирования отдельных клеток в различных тканях. Все часы, которые мы использовали, показали высокую точность (r> 0,8) в предсказании возраста тестовых выборок и были чувствительны к возраст-связанным состояниям  и интервенциям долголетия (Таблица 2).

Рисунок S1. Разработка часов мульти-тканевого метилирования рибосомной ДНК (рДНК) мыши. (A) Распределение выборки, используемое для обучения и тестирования. (B) Нахождение оптимального лямбда-параметра (0,0001) ElasticNet с использованием 5-кратной перекрестной проверки. (C) Производительность часов рДНК на мультитканевой тестовой выборке и тестовой выборке крови, оба в нормальных / контрольных условиях.  
  

Рисунок S2. Применение часов мульти-тканевой рДНК к различным моделям старения и воздействиям на долголетие.(A) Ограничение калорийности (оранжевый) по сравнению со стандартной диетой (синие) мышей C57BL / 6.(B) Ограничение калорийности 21-месячных мышей по сравнению со стандартной диетой, получавших 20-месячных мышей B6D2F1.(C) Ограничение калорийности 27-месячных мышей по сравнению со стандартной диетой, получавших 27-месячных мышей B6D2F1.(D) Мыши с нокаутом рецептора гормона роста (возраст 6 месяцев) по сравнению с мышами дикого типа (возраст 6 месяцев).(E) Карликовые мыши Snell в возрасте 5-6 месяцев по сравнению с контрольными мышами.(F) Фибробласты легких и почек мыши по сравнению с индуцированными фибробластами плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).  

Таблица 1. Наборы данных о метилировании эмбриональной ДНК, использованные в этом исследовании.

Таблица 2. Часы эпигенетического старения, использованные в этом исследовании.

Во-первых, мы изучили поведение часов rDNAm при применении к пяти независимым наборам данных ранних эмбрионов мышей. Мы обнаружили, что средний эпигенетический возраст эмбрионов E6.5 / E7.5 был постоянно ниже, чем на более ранних стадиях эмбриогенеза (рис. 1B, рис. S3AB, рис. S4AB). Мы также применили четыре вида геномных часов эпигенетического старения на основе RRBS к наборам данных RRBS (наборы данных 1 и 2). Это снова показало, что эпигенетический возраст эмбрионов E6.5 / E7.5 ниже, чем в период от зиготы до бластоцисты (рис. 1C, рис. S3CD, рис. S4CD). Таким образом, эпигенетический возраст уменьшается на раннем этапе эмбриогенеза, и поэтому эмбриональные клетки не только не стареют в этот период, но и в какой-то момент омолаживаются.

Рисунок S3. Часы старения показывают событие омоложения во время раннего эмбриогенеза. (A) Мульти-тканевые часы и часы рДНК крови, примененные к пяти наборам данных, охватывающих первые 8 дней эмбриогенеза мышей (таблица 1, наборы данных 1-5). Отображается прогнозируемый эпигенетический возраст (изменение масштаба не применяется). Для каждого графика мы указываем количество сайтов CpG часов, которые были включены в набор данных приложения («перекрытие»). Синие линии показывают среднее значение каждой группы; p-значение двустороннего t-критерия сравнивает среднее значение двух групп.(B) Часы метилирования рДНК крови, примененные к тем же пяти наборам данных.(C) Применение четырех общегеномных часов эпигенетического старения к набору данных 1.(D) Применение четырех общегеномных часов эпигенетического старения к набору данных 5. 

Рисунок S4. Часы старения показывают событие омоложения во время раннего эмбриогенеза. (A) - (D), тот же анализ, что и на рис. S3, но с разделением по типу образца (вместо эмбрионального времени). Также отображается эпигенетический возраст гамет и взрослых образцов (сердце, мозг и печень). 

Рисунок S5. Метилирование рибосомной ДНК связано с возрастом в разных тканях мышей C57BL / 6J. Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена с возрастом (Rho) для сайтов CpG в последовательности рДНК. Значимые корреляции после коррекции Бонферрони (p < 0,05 / n) обозначены оранжевым цветом. 

Рисунок S6. Средний уровень метилирования CpG-сайтов рибосомальной ДНК мыши, измеренный в различных наборах данных. (A) Образцы разделяются по эмбриональному времени. (B) Образцы разделены по типу. 

Ранее, почти нулевой эпигенетический возраст человеческих эмбриональных стволовых клеток и ИПСК был продемонстрирован мульти-тканевыми часами Хорватии даже после обширного пассирования (18). Мы проанализировали ИПСК и ЭСК на основе нескольких доступных в настоящее время наборов данных, чтобы дополнительно оценить, имеют ли эти клетки, которые соответствуют раннему эмбриогенезу, возраст (рис. 1D). Эпигенетический возраст клеток был очень низким (в основном ниже нуля) даже после более чем 100 пассажей. Даже в искусственных условиях культивирования, при уровне кислорода выше физиологического и при количестве пассажей, значительно превышающих физиологический (что может привести к накоплению вредных мутаций), либо не наблюдалось увеличения эпигенетического возраста, либо наблюдалось очень небольшое увеличение. Эти данные подтверждают мнение о том, что клетки, соответствующие ранним стадиям эмбриогенеза, по существу не стареют.

Организменное старение у мышей и людей начинается в середине эмбрионального развития.

Мы количественно оценили эпигенетический возраст, применив часы рДНК к единственному доступному набору данных мышей, который содержит образцы как ранних, так и поздних эмбрионов (рис. 2A). Эпигенетический возраст на E6.5 и E7.5 был значительно ниже, чем на E13.5 (первичные клетки зародышевой линии, которые являются прямыми предшественниками сперматозоидов и ооцитов).

Рис. 2. Организменное старение начинается в середине эмбрионального развития мыши и человека.   (A) Эпигенетический возраст (часы мульти-ткани и рДНК крови) анализ набора данных, который содержит образцы как ранних, так и поздних эмбрионов мыши (образцы E13.5 основаны на первичных клетках зародышевой линии). (B) Применение полногеномных эпигенетических часов на более поздних стадиях эмбриогенеза мышей (r, коэффициент корреляции Пирсона; p, p-значение корреляции). (C) Те же данные, что и выше, но разделенные тканью. Тенденция к увеличению наблюдается почти для всех тканей, за некоторыми незначительными исключениями. (D) Эпигенетическая возрастная динамика четырех независимых массивов пренатальных наборов данных 450k метилирования человека на основе мультитканевых часов человека Horvath. (E) Те же данные, что и выше, но разделенные по тканям (5 значительных увеличений, 9 незначительных увеличений, 4 незначительных уменьшения, 0 значительных сокращений). 

Мы также оценили эпигенетический возраст эмбрионов мыши в 9 временных точках от эмбрионального дня 10,5 до рождения (набор данных 6) с помощью часов метилирования всего генома. В течение этого периода наблюдалось последовательное увеличение эпигенетического возраста как при рассмотрении всех данных (рис. 2B), так и при разделении по тканям (рис. 2C). Кроме того, мы проанализировали пренатальные наборы данных человека, применив часы Horvath multi-fabric DNAm к четырем независимым массивам данных 450K метилирования человека (наборы данных 7–9). Увеличение (или, в некоторых случаях, отсутствие изменений) эпигенетического возраста наблюдалось как при рассмотрении всех данных (рис. 2D), так и для каждой ткани (рис. 2E). Таким образом, в определенный момент во время эмбрионального развития у мыши и человека биологический возраст начинает увеличиваться в большинстве или во всех тканях. Учитывая, что эпигенетические часы отслеживают процесс старения, данные предполагают, что к тому времени организмы уже стареют.

Эпигенетический возраст ЭСК мыши во время раннего пассирования

Мы оценили эпигенетический возраст эмбриональных стволовых клеток мыши после роста (пассаж 0) и раннего пассажа (пассаж 5) в трех различных условиях культивирования (рис. 3AB). В отсутствие двух ингибиторов (PD0325901, который вызывает блокаду дифференцировки, и CHIR99021, который поддерживает самообновление (45)), мы наблюдали более низкий эпигенетический возраст после отрастания по сравнению с состоянием, когда были включены два ингибитора. Данные предполагают, что ESC в условиях неполного самообновления культуры могут продолжать свое развитие (без самообновления) и омолаживаться, подобно тому, что мы наблюдали in vivo (Рис. 1).

Рис. 3. Эпигенетический возраст ЭСК мыши при раннем пассировании в различных условиях культивирования.   (A) Эпигенетический возраст (по часам рДНК) мышиных ESC после разрастания (пассаж 0) и пассажа 5 в трех различных условиях культивирования (2i, используются оба ингибитора, поддерживающих самообновление; PD, только один ингибитор; mES, без ингибитора). (B) Применение полногеномных эпигенетических часов мыши к тем же данным. (C) Анализ основных компонентов (PCA) профилей метилирования RRBS эмбрионов (кружки) и ESC (крестики) групп образцов после пассажа 0 (слева) и пассажа 5 (справа). Выпуклая оболочка вокруг образцов ESC в той же группе (если n> 2) отображается, чтобы помочь отличить образцы ESC от образцов эмбриона. 

Локализация эпигенетического минимума возраста (нулевой точки) во время эмбрионального развития мыши

Мы объединили результаты для ранних и более поздних стадий эмбриогенеза, применив полногеномные мышиные эпигенетические часы (рис. 4A) и часы рДНК (рис. 4B). Переменное количество перекрывающихся участков часов на всех этапах вызвало cовокупный эффект сдвига фактического прогнозируемого возраста между ранними и поздними этапами. Однако эпигенетическая возрастная динамика показывала четкую U-образную структуру в каждом случае с минимумом на уровне E6,5 / E7,5 в четырех случаях и E10,5 в двух случаях. Результаты показывают, что нулевой уровень может лежать в диапазоне от E4,5 до E10,5. Чтобы уточнить интервал, мы также проанализировали набор данных, содержащий средние эмбриональные стадии от E3.5 до E11.5 [набор данных 20, (46)]. Минимальный эпигенетический возраст находился на уровне E6,5 / E7,5 в пяти случаях и на уровне E8,5 в одном случае (рис. 4, C и D, и рис. S7). В совокупности наши данные предполагают, что нулевой уровень может лежать в диапазоне от E4,5 до E10,5, наиболее вероятно, в E6,5 / E7,5. После этого омоложения начинается старение организма.

Рис. 4. Локализация эпигенетического минимума возраста (нулевой точки) во время эмбрионального развития мыши.   (А) Мы объединили результаты за весь период эмбриогенеза, используя указанные эпигенетические часы мыши в масштабе всего генома. (Б) Мы объединили результаты за весь период эмбриогенеза, используя указанные эпигенетические часы рДНК мыши. (C) Применение эпигенетических часов мыши в масштабе всего генома к набору данных 20, который содержит промежуточные эмбриональные стадии от E3.5 до E11.5. (D) Применение эпигенетических часов мыши с рДНК к набору данных 20. 

Заключительные комментарии, обсуждение

Еще в 19 веке Август Вейсманн предложил идею наследственной нестареющей зародышевой линии и одноразовой стареющей сомы. Тем не менее, в зародышевой линии наблюдаются молекулярные изменения, характерные для старения (7–9). Наше исследование предполагает, что зародышевые линии стареют, но омолаживаются у потомства в какой-то момент во время раннего эмбриогенеза. Это омоложение происходит на ранних стадиях после имплантации, когда потомство достигает минимального биологического возраста. Мы предполагаем, что этот минимум, точка отсчета, знаменует начало старения организма. Потомство естественным образом переходит к нулевому уровню из стадии зиготы, но соматические клетки также могут быть вынуждены перейти на эту молодую стадию, например путем перепрограммирования с факторами Яманака (или другими методами), генерируя ИПСК. Улучшение связанных с возрастом признаков in vivo уже было продемонстрировано частичным перепрограммированием (46). Совсем недавно частичное перепрограммирование восстановило зрение у мышей путем сброса молодой эпигенетической информации (47). Таким образом, и сома, и зародышевые линии могут стареть и омолаживаться.

Ранний эмбриогенез, когда мы наблюдали период омоложения, также сопровождается другими молекулярными изменениями в подготовке к жизни организма, такими как постепенное удлинение теломер (48), волны глобального деметилирования и метилирования (49), переход от использования материнских генных продуктов к продуктам самого эмбриона, инактивация хромосомы X и развитие моноаллельной экспрессии генов (50). Омоложение также должно включать уменьшение молекулярных повреждений и других вредных возрастных изменений, которые накапливаются в родительской зародышевой линии (51, 52). Данные показывают, что нулевой уровень у мышей находится между E4,5 и E10,5, а текущие оценки показывают, что он близок к E6,5 / E7,5. Этот период примерно соответствует гаструляции, когда формируются три зародышевых листка. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы точно определить местонахождение нулевой точки у людей и мышей.

Начало старения является предметом споров. Часто обсуждается, что старение начинается после завершения развития, в начале воспроизводства и в то время, когда сила естественного отбора начинает уменьшаться. Однако наш недавний анализ пагубных возрастных изменений показал, что старение начинается в раннем возрасте, даже до рождения (53). Наша текущая работа теперь привязывает начало старения к нулевой точке (ground zero).

Сайты CpG, связанные со старением и продолжительностью жизни, могут быть как гипометилированы, так и гиперметилированы при старении (54). Привлекательная возможность состоит в том, что омоложение может поддерживаться реметилированием, а не деметилированием. Действительно, глобальное реметилирование было зарегистрировано между E3.5 и E7.5 (49, 55-57), что является тем же периодом, когда мы наблюдаем омоложение. Если глобальное реметилирование действительно связано с уменьшением эпигенетического возраста, нулевой уровень и максимум глобального метилирования должны соответствовать одной и той же стадии развития. Это имело бы смысл с той точки зрения, что для устранения «эпигенетического повреждения» геном должен быть сначала частично деметилирован, а затем снова реметилирован.

Мы также обнаружили, что клетки, соответствующие раннему эмбриогенезу, то есть ЭСК и ИПСК, не стареют при культивировании и пассировании. Однако раннее пассирование, по-видимому, приводит к эпигенетическому снижению возраста. В соответствии с этим сокращением возраста было обнаружено, что первоначально пассирование вызывает удлиннение теломер, и что мыши, полученные из этих омоложенных клеток, живут дольше и лучше защищены от возрастных заболеваний, чем мыши из тех же клеток, которые не были пассированы (58). Это предполагает захватывающую возможность того, что событие естественного омоложения, которое мы раскрываем в этой работе, может быть целевым, так что организмы могут начинать стареть в более низком биологическом возрасте и, следовательно, могут достичь более высокой продолжительности жизни и более высокой продолжительности здоровой жизни. Это также может быть полезно во время оплодотворения in vitro, когда приоритет может отдаваться эмбрионам с более низким биологическим возрастом.

Глобальное метилирование цитозина (средний уровень метилирования сайтов CpG, представляющих весь геном) изменяется волнообразно во время эмбриогенеза млекопитающих: первоначальное снижение от зиготы до E3.5 сопровождается увеличением до E6.5 / E7.5 (49), и уникальной тканеспецифической динамикой во время / после органогенеза (59). Однако глобальное метилирование цитозина показывает очень мало изменений после рождения (60), и, следовательно, не дает точных прогнозов биологического возраста или его снижения. Напротив, возраст, прогнозируемый часами эпигенетического старения (обычно на основе нескольких сотен сайтов CpG), показывает сильную корреляцию с возрастом (r> 0,8), указывая на то, что его можно использовать для прогнозирования биологического старения и омоложения (Таблица 2).

В целом, эта работа идентифицирует естественное событие омоложения в раннем возрасте и предполагает, что старение организма начинается во время эмбриогенеза, примерно во время гаструляции. Эти открытия дают возможность понять, что влечет за собой этот процесс раннего омоложения, похож ли он на перепрограммирование Яманаки и может ли он быть вызван в соматических клетках для их омоложения.

Вклад авторов

В.Н.Г. задумал и руководил исследованием. C.K. собрали данные, провели анализ данных и разработали часы мульти-тканевой рДНК. Б.З. создал схематический рисунок и помог с анализом данных и обсуждениями. Все авторы интерпретировали результаты. В.Н.Г. и С.К. написали текст. Б.З., С.Л. и А.Т. редактировали текст.

Доступность данных и доступность кода

Уровни метилирования сайтов CpG рДНК будут доступны для всех наборов данных о мышах после публикации вместе с кодами рабочего процесса эпигенетических часов.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Сбор и обработка наборов данных секвенирования

Необработанные последовательности были загружены и извлечены с помощью SRA Toolkit. Чтения были обрезаны, а качество отфильтровано TrimGalore! v0.6.4 с использованием параметра --rrbs для RRBS. Уровни метилирования были извлечены с использованием Bismark v0.22.2 (70) в двух отдельных процессах: (i) для часов рДНК, чтения были сопоставлены с последовательностью рДНК мыши (BK000964.3), (ii) для геномных часов, чтения были сопоставлены с полной последовательностью генома мыши (mm10 / GRCm38.p6). Метилированные и неметилированные цитозины технических повторов суммировали для каждой позиции. В случае набора данных 6 мы напрямую использовали доступные файлы BED (URL-адреса были извлечены из файлов GEO).

Фильтрация сайтов CpG и вменение наборов данных RRBS / WGBS

Наша стратегия фильтрации была оптимизирована для достижения трех конкурирующих целей: (i) максимально возможное покрытие чтения; (ii) максимально возможное перекрытие сайтов часов; и (iii) сравнение наилучших (объективных) выборок. Мы использовали только те сайты CpG, которые охвачены по крайней мере 5 чтениями (или 50 в двух наиболее покрытых случаях, когда часы рДНК применялись к наборам данных 2 и 3) по крайней мере в 90% выборок данного набора данных. В случае набора данных 6 мы просто использовали сайты CpG, которые охватываются как минимум 5 чтениями без каких-либо других ограничений (чтобы избежать слишком большого количества пропущенных значений). Мы исключили два образца самого низкого качества (оба были ооцитами) набора данных 1 для геномного анализа. Недостающие значения часовых сайтов были вменены средними уровнями метилирования покрытых часовых участков для всех образцов. Наша стратегия вменения привела к единому числу для каждого тактового сигнала и набора данных, что позволило менее предвзято сравнивать выборки по сравнению с методом, который вменяет разные значения для каждой выборки. Мы использовали среднее по часам вместо среднего по всем сайтам, потому что мы предположили, что уровни метилирования CpG  у сайтов часов ближе друг к другу, чем к другим сайтам.

Применение эпигенетических часов мыши к наборам данных RRBS / WGBS

В применении ранее разработанных часов мы руководствовались описаниями авторов. Все доступные часы мыши, которые мы использовали, были основаны на линейной регрессии (таблица 2). Мы использовали параметры, предоставленные авторами. Трансформация была также применена в случае кровяных часов Петковича (30), многотканевых часов Стаббса (31) и часов рДНК крови (35). В случае многотканевых часов Стаббса начальная нормализация была проделана с помощью опубликованного обучающего набора. Применение часов на основе RRBS с сайтами, разбросанными по геному, часто является сложной задачей из-за различного количества покрытых сайтов часов, что приводит к отсутствующим значениям. Поэтому мы требовали, чтобы покрытие сайтов часов составляло не менее 25%. Сайты часов на основе RRBS не имели достаточного покрытия, когда мы применяли их к наборам данных 2, 3 и 4 (все они являются наборами данных WGBS).

Рабочий процесс часов с одной клеткой

Уровни метилирования получали с помощью рабочего процесса картирования рДНК, описанного выше. В итоге мы получили данные о метилировании для каждой из 758 клеток отдельно. Мы использовали только те сайты CpG, которые были охвачены по крайней мере 5 чтениями и показали стабильные уровни метилирования (выше 0,8 или ниже 0,2). Затем мы случайным образом разделили клетки на две группы для каждой стадии эмбриона (всего 8 групп клеток). Мы вычислили средний статус метилирования для каждого сайта CpG каждой из 8 групп (ранее статус метилирования был переназначен на 0 или 1). Наконец, мы применили часы рДНК к 8 группам, так как это было бы для 8 образцов  балк-секвенирования.

Применение часов DNAm  человека к массивам данных метилирования 450K

Наборы данных были загружены из базы данных GEO. Мы переиндексировали данные в массив 27K и использовали сценарий R калькулятора Horvath DNAm, как описано в руководстве (TUTORIAL1). В случае наборов данных PSC мы анализировали только ESC, полученные из нормальных оплодотворенных бластоцист, и iPSC, полученные из нормальных клеток (то есть иммортализованные клетки были исключены).

Разработка часов мульти-тканевой рДНК мыши

Набор данных RRBS мышей с несколькими тканями (GSE120132) использовался для обучения и тестирования часов путем перекрестной проверки. Дополнительный набор данных RRBS мышей крови (GSE80672) был использован для тестирования образцов независимого исследования. Необработанные последовательности были загружены из базы данных SRA. Чтения были обрезаны, а качество отфильтровано TrimGalore! v0.6.4, а уровни метилирования экстрагировали с помощью Bismark v0.22.2. путем сопоставления с последовательностью рДНК мыши (BK000964.3). Были объединены файлы Fastq технических повторов. Мы использовали только сайты CpG (и только цитозины с положительной цепью), которые охватываются как минимум 50 чтениями во всех выборках обоих наборов данных. Мы использовали только C57BL / 6J из набора данных GSE120132 и пропустили образцы мышц, потому что мы наблюдали низкую возрастную корреляцию сайтов CpG мышечной рДНК (рис. S5). После фильтрации для обучения и тестирования оставалось 166 образцов (рис. S2A). Затем была проведена 5-кратная перекрестная проверка всех 166 образцов для различных лямбда-параметров ElasticNet (Scikit-learn v0.23.2), чтобы найти оптимальный параметр лямбда (рис. S1B). Мы повторно обучили окончательную модель (фактические часы) на том же наборе данных с оптимальным параметром (лямбда 0,0001) на случайных 80% всех выборок и протестировали на остальных выборках (рис. S1C, таблица S1). Наша окончательная модель показала производительность, аналогичную средней производительности перекрестной проверки. Однако тестирование модели на наборе данных перекрестной проверки может привести к завышению производительности. Чтобы решить эту проблему, мы также проверили нашу модель в независимом тесте. То есть мы проверили мульти-тканевые часы на 153 нормальных (контрольное питание, дикий тип) образцах крови C57BL / 6J (рис. S1C). Мы также применили его при возрастных заболеваниях (рис. S2).

Благодарности

Авторы благодарят Сун Хи Йим, Анастасию Шиндяпину, Маргариту Меер, Марко Мариотти, Максима Геращенко за обсуждение. При поддержке грантов NIH V.N.G.

Опубликовано: 12.03.2021г.

Обновлено: 25.06.2021г.

Авторы: Csaba Kerepesi, Bohan Zhang, Sang-Goo Lee, Alexandre Trapp, Vadim N. Gladyshev

Оригинальная статья: Epigenetic clocks reveal a rejuvenation event during embryogenesis followed by aging 

Обновленная статья: Epigenetic clocks reveal a rejuvenation event during embryogenesis followed by aging (advances.sciencemag.org)

Перевод Ник Сестрин

 Авторы: Александр Трапп, Чаба Керепеси, Вадим Николаевич Гладышев

Введение

Один из канонических признаков старения это глубокие эпигенетические изменения, особенно в динуклеотидах CG (CpG) ( Horvath & Raj, 2018 ; López-Otín et al., 2013 ). Изменения в метилировании CpG с возрастом теперь можно анализировать с использованием различных подходов, от массивов гибридизации до полногеномных или целевых методов секвенирования следующего поколения ( Han, Franzen, et al., 2020 ; Horvath, 2013 ; Lister et al. , 2009 ; Meissner et al., 2005 ). Эти методы позволяют проводить количественное исследование динамического ландшафта метилирования ДНК с точностью до одного нуклеотида в любой интересующей ткани организмов, развивших данный тип регуляции, таких как млекопитающие.

С момента своего создания в последнее десятилетие прогнозирующие многовариантные модели машинного обучения, основанные на уровнях метилирования ДНК (DNAm), получившие название `` эпигенетические часы '', произвели революцию в области изучения старения ( Bocklandt et al., 2011 ; Horvath, 2013 ). Часы, изначально построенные лишь для оценки хронологического возраста, теперь могут также интегрировать и прогнозировать различные показатели биологического старения и риска заболеваний, что подчеркивает их клиническую значимость ( Levine et al., 2018 ; Lu et al., 2019 ). Интересно, что недавно было разработано несколько пан-тканевых часов для млекопитающих, которые могут с впечатляющей точностью определять эпигенетический возраст практически в любой ткани млекопитающих ( Mammalian Methylation Consortium, 2021). Помимо этих замечательных достижений, эпигенетические часы представляют особый интерес, поскольку эти модели обещают обнаруживать даже небольшие изменения биологического возраста в результате различных интервенций для увеличения продолжительности жизни или  перепрограммирования клеток ( Lu et al., 2020 ; Petkovich и др., 2017 ).

Однако, хотя единицами жизни являются отдельные клетки, все существующие эпигенетические часы полагаются на измерения, полученные из массивных образцов (то есть образцов, содержащих множество клеток), как для создания, так и для применения этих моделей ( Bell et al., 2019 ). Исторически сложилось так, что использование массивных образцов для анализа метилирования ДНК было неотъемлемым требованием доступных методологий, которые требовали сотни нанограмм исходного материала из-за жесткой химической обработки ДНК бисульфитом ( Karemaker & Vermeulen, 2018 ). Хотя использование объемной ткани и удобно, оно по сути скрывает эпигенетическую гетерогенность, существующую между отдельными клетками ( Bell et al., 2019 ; Gravina et al., 2016). Есть недавняя работа , где были рассмотрены характеристики транскриптомных изменений при старении мышей на уровне отдельных клеток, но детальные эпигенетические изменения отдельных клеток и тканей во время старения  млекопитающих остаются в основном неизученными ( Almanzar et al., 2020 ).

Недавние успехи в методах эпигеномного секвенирования позволили оценить ограниченные профили метилирования в отдельных клетках. С момента появления этих методов за предыдущее десятилетие появилось множество методов секвенирования метилирования отдельных клеток, в том числе бисульфитное секвенирование с пониженным представлением отдельных клеток

(scRRBS) и бисульфитное секвенирование одной клетки (весь геном) (scWGBS / scBS) ( Gravina et al. al., 2016 ; Guo et al., 2013 ; Smallwood et al., 2014). Эти подходы основаны на ключевых модификациях оригинальных методик с объемными образцами, которые позволяют снизить потерю ДНК во время подготовки библиотеки. Интересно, что были также разработаны новые методы секвенирования РНК, метилирования ДНК и доступности хроматина в одной и той же клетке, что позволяет интегрировать мультиомиксные анализы с максимальным разрешением ( Angermueller et al., 2016 ; Argelaguet et al., 2019 ; Кларк и др., 2018 ).

Несмотря на этот замечательный прогресс в омиках одиночных клеток, остаются общие проблемы разреженности. В зависимости от конкретного используемого метода, только небольшая часть CpG, охваченных методами массового секвенирования, представлена ​​в отдельных клетках ( рис. 1а , рис. S1 ). Более того, наиболее распространенные протоколы для профилирования метиломов отдельных клеток - те, которые включают в себя исследование паттернов метилирования ДНК в масштабе всего генома - дополнительно страдают от эффективного случайного охвата считываний ( Karemaker & Vermeulen, 2018 ). Чтобы преодолеть этот ограничивающий фактор, анализ профилей метилирования отдельных клеток обычно проводится путем усреднения уровней метилирования в геномных областях ( Angermueller et al., 2016 ; Luo et al., 2017). В качестве альтернативы также было разработано несколько стратегий вменения и кластеризации, использующих байесовские подходы или подходы глубокого обучения для заполнения недостающих состояний метилирования для CpG, не охваченных в данной клетке ( Angermueller et al., 2017 ; Kapourani & Sanguinetti, 2019 ). Хотя эти методы вменения работают очень хорошо при различении клеточных подтипов друг от друга, они полагаются на построение моделей для конкретных наборов данных, что затрудняет проведение объективных сравнений между исследованиями.

Рисунок S1: Практические различия в результатах методов массового и одноклеточного эпигенетического секвенирования Схематическое сравнение подходов к секвенированию массового (слева) и одноклеточного (справа) метилирования. Использование объемных выборок обеспечивает высокий и постоянный охват CpG, в то время как профили отдельных клеток обычно страдают от эффективного случайного и разреженного покрытия. Объемные образцы дают непрерывные значения от 0 до 1 (из-за наличия считываний из разных клеток), в то время как образцы отдельных клеток демонстрируют в основном дигитальное метилирование. Следовательно, обычные таблицы характеристик (внизу), используемые для обучения часов регрессии эластичной сети, невозможно создать для отдельных клеток из-за наличия большого количества недостающих данных.  
  

Рисунок 1: Разработка scAge а) Схема дифференциального выравнивания считывания с помощью с группового (слева) и отдельноклеточного (справа) методов эпигеномного секвенирования. Уменьшение ввода ДНК для отдельных клеток приводит к меньшему количеству отображенных считываний (синий) в эталонном геноме (серый), что приводит к уменьшению покрытия CpG по сравнению с объемными образцами. б) Схематическое изменение линейной зависимости между уровнем метилирования и возрастом. Используя групповые образцы разного возраста, можно отобразить, как уровень метилирования (зеленая ось) влияет или предсказывает возраст (красная ось). Напротив, можно установить и обратное соотношение, при котором возраст может использоваться в качестве предиктора среднего уровня метилирования. в) Вычисление формул линейной регрессии для каждого CpG в наборе обучающих данных. Уровень метилирования CpG может увеличиваться, уменьшаться или не иметь явной линейной зависимости с возрастом. Met обозначает средний уровень метилирования, a указывает наклон линейного уравнения, а b представляет собой точку пересечения вдоль оси метилирования. г) Схематическое пересечение и этап фильтрации scAge. CpG в наборе обучающих данных (розовый) пересекаются с таковыми в отдельных клетках (синий / оранжевый). CpG в одной отдельной клетке показывают ограниченные пересечения с CpG в другой отдельной клетке. Общие CpG между любой одной клеткой и набором данных массового обучения ранжируются на основе их абсолютной корреляции | r | с возрастом. Только верхние коррелированные общие CpG (темно-фиолетовые пересечения) в каждой клетке принимаются в качестве входных данных для алгоритма scAge. д) Схема основного алгоритма scAge. Апостериорные вероятности вычисляются на основе наблюдаемых состояний метилирования в отдельных клетках для каждого возрастного шага. Закрашенный кружок указывает на метилированный CpG, а белый кружок указывает на неметилированный CpG в конкретной отдельной клетке. Метрика правдоподобия для профиля вычисляется как произведение всех независимых вероятностей на CpG. На практике это оценивается как сумма логарифма правдоподобия для преодоления вычислительных ограничений потери значимости. е) Схематическое представление распределения зависящих от возраста показателей логарифмического правдоподобия в молодой и старой клетках.  

Общая разреженность профилей DNAm отдельных клеток создает серьезные ограничения для создания отдельноклеточных эпигенетических часов. Построение этих прогностических моделей традиционно основывалось на сборе уровней метилирования CpG, которые последовательно охватывались между выборками разного возраста ( Meer et al., 2018 ; Stubbs et al., 2017 ; Thompson et al., 2018 ). В объемной ткани это позволяет создавать большие таблицы характеристик, которые затем можно напрямую использовать для машинного обучения, в частности, для эластичной сетевой регрессии ( Zou & Hastie, 2005 ). Однако разреженные и бинаризованные профили метилирования отдельных клеток препятствуют применению этого подхода ( рис. S1 ) ( Bell et al., 2019). Несмотря на эти проблемы, создание отдельноклеточных эпигенетических часов обещает новые методы эпигенетического профилирования возраста со сверхнизким входом в сочетании с беспрецедентно подробным наблюдением процесса старения.

Здесь мы разработали scAge, новый метод, способный определять эпигенетический возраст отдельных клеток. Из-за низкого и непоследовательного покрытия CpG наш подход вместо этого полагается на вероятностный алгоритм, который в значительной степени не зависит от того, какие CpG покрываются в каждой клетке. Используя линейную взаимосвязь уровней метилирования с возрастом в подмножестве CpG, мы создаем показатель правдоподобия, который количественно определяет вероятность того, что клетка происходит из основной выборки данного возраста. Наш метод воспроизводит хронологический возраст ткани в среднем, а также раскрывает внутреннюю эпигенетическую гетерогенность, существующую между клетками. Использование этих вероятностных эпигенетических часов открывает новые захватывающие возможности для исследований биологического старения на ранее неуловимом уровне отдельных клеток.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработка scAge: вероятностные отдельноклеточные эпигенетические часы

Основными проблемами при оценке возраста одиночных клеток являются их разреженные и бинаризованные профили метилирования. В отличие от массовых выборок, последовательные считывания охватывают разные части генома каждой отдельной клетки с очень низким перекрытием между клетками ( рис. 1a , рис. S1.). Чтобы преодолеть эти ограничения, мы предположили, что уровни метилирования сайтов CpG с высоким покрытием  при групповом секвенировании или профилировании массива DNAm ткани предлагают оценку вероятности метилирования в этих конкретных сайтах CpG в любой отдельной клетке, происходящей из этой ткани. Кроме того, мы перевернули общепринятое представление о взаимосвязи между уровнем метилирования и возрастом: в то время как текущие групповые часы используют уровень метилирования в качестве предиктора возраста, мы предположили, что возраст можно рассматривать как предиктор уровня группового метилирования для любого данного CpG ( рис. . 1b ). Используя данные обучения, полученные из групповых RRBS, мы оценили изменение средних уровней метилирования с возрастом для каждого CpG в этом эталонном наборе, используя одномерные линейные модели ( Fig. 1c ).

Затем мы изолировали общие сайты CpG между любым заданным профилем отдельных клеток и эталонным набором данных вероятности метилирования ( рис. 1d) . Затем мы выбрали определенное количество общих CpG, которые показали наибольшую абсолютную корреляцию Пирсона с возрастом в массиве данных (т. Е. Связанных с возрастом сайтов CpG). Важно отметить, что из-за разреженности профилей DNAm отдельных клеток, покрытые сайты CpG сильно различаются от клетки к клетке; несмотря на это, небольшая, но отчетливая коллекция ассоциированных с возрастом сайтов CpG была охвачена в каждой секвенированной клетке ( Fig. 1d ).

Затем мы вычислили вероятность наблюдения этого профильтрованного профиля метилирования отдельной клетки в любом заданном возрасте ( Рис. 1e ). На практике мы использовали логарифмы (логарифм правдоподобия), чтобы избежать ошибок переполнения во время вычислений. Наконец, мы определили возраст, для которого эта вероятность максимальна ( рис. 1е ). Мы обнаружили, что этот подход, который мы назвали scAge, позволяет точно определить эпигенетический возрастной профиль в отдельных клетках с очень разными и разреженными профилями метиломов.

Вероятностные одноклеточные часы рекапитулируют хронологический возраст отдельных гепатоцитов.

Сначала мы применили scAge к терминально дифференцированным клеткам очень молодых и очень старых мышей, включая 11 одиночных гепатоцитов от 4-месячных животных и 10 одиночных гепатоцитов от 26-месячных животных ( Gravina et al., 2016 ). Профили отдельных клеток содержали ограниченное число общих CpG для любой взятой пары клеток; фактически, этот эффект усиливается, когда сайты в дополнительных клетках прогрессивно пересекаются, что приводит к минимальному окончательному перекрытию ( Fig. 2a ). Охват варьировал от 0,4 до 3,2 миллиона CpG в гепатоцитах со сходным средним глобальным метилированием в молодых и старых клетках ( рис. 2b , рис. S2a ). Сначала мы применили наши вероятностные часы, обученные на объемных образцах печени ( рис. 2c ) ( Thompson et al., 2018). Примечательно, что при использовании только 700 независимых CpG на клетку scAge продемонстрировал впечатляющую точность и согласованность в предсказаниях возраста молодых и старых гепатоцитов ( рис. 2d ). Мы достигли коэффициента Пирсона 0,88 со средней и медианной абсолютными ошибками 3,9 и 2,9 месяца соответственно. Таким образом, scAge печени правильно воспроизводит возраст исходной ткани с помощью небольшого количества клеток.

Рисунок S2:Покрытие одиночной клетки CpG варьируется в зависимости от набора данных Охват CpG в (а) MEF, гепатоциты 4- и 26-месячного возраста; (б) 1,5-месячные и 26-месячные мышечные стволовые клетки; (c) ооциты MII, ESC, культивируемые в условиях 2i или сыворотки, и эмбриоидные тельца; и (d) эмбриональные клетки от E4.5 до E7.5. На основе профиля покрытия и количества клеток в каждом наборе данных применялась фильтрация для удаления клеток с очень низким покрытием (черные пунктирные линии). Пороговое значение не было установлено в (a) из-за низкого количества клеток, пороговое значение в 1000000 CpG было обозначено в (b) и (c) , а пороговое значение в 500000 CpG было установлено в (d) для оптимизации как согласованности прогнозов, так и наибольшего количество клеток на исследование. 

Рисунок 2:scAge рекапитулирует возраст гепатоцитов и эмбриональных фибробластов а) Прогрессивное пересечение сайтов CpG в каждом отдельном гепатоците. Порядок пересечений менялся 100 раз, чтобы получить распределения для каждой добавленной дополнительной клетки. Ось Y логарифмически преобразована. Минимальные общие CpG остаются после пересечения всех клеток. б) Среднее метилирование в MEF, 4-месячных и 26-месячных гепатоцитах. ** означает p <0,01. в) Схематическое изображение часов scAge печени. г) Прогнозирование эпигенетического возраста для всех молодых и старых гепатоцитов с использованием часов scAge печени. д) Схематическое изображение мультиканальных часов. Были включены ткани печени, легких, почек, мышц, жировая ткань и кровь. е) Прогнозирование эпигенетического возраста для всех молодых и старых гепатоцитов с использованием мультитканевых часов SCAge. Применение часов ScAge печени (g) и часов scAge для нескольких тканей (h) на эмбриональных фибробластах мыши (MEF) по сравнению с молодыми и старыми гепатоцитами. * обозначает p <0,05, ** обозначает p <0,01, а *** обозначает p <0,001. 

Хотя scAge хорошо помогает интегрировать прогнозы для нескольких отдельных клеток в точный предиктор общего возраста ткани, он также по своей сути обеспечивает повышенное разрешение вплоть до отдельных клеток. Действительно, некоторые клетки в одной и той же ткани были моложе или старше других. Самый низкий прогноз с использованием печеночных часов для молодых клеток был близок к 0, при этом возраст одной клетки был около 20 месяцев. Эти результаты предполагают глубокую гетерогенность процесса старения, при котором глобальные изменения эпигенетического возраста в основной ткани характеризуются неравномерными и разнообразными траекториями старения, которым подвергаются отдельные клетки.

Мы также использовали scAge, обученный на наборах данных по тканям почек, крови, печени, легких, мышц и жировой ткани ( рис. 2e ) ( Thompson et al., 2018 ). Поскольку мультитканевые наборы данных накладывают биологический шум на взаимосвязь между возрастом и уровнем метилирования в большинстве CpG, абсолютные корреляции между обеими переменными резко упали по сравнению с набором данных только для печени ( Рис. S3 ). В связи с этим мы пришли к выводу, что при использовании мультитканевого набора данных прогнозные показатели улучшатся, если для расчета вероятности возраста будет учитываться больше CpG в расчете на одну клетку. Таким образом, мы использовали мультитканевый предиктор scAge с 2000 CpG, профилированным на одну клетку. Эта модель показала уменьшение точности по сравнению с моделью печени, коэффициент корреляции Пирсона 0,63 (Spearman rho = 0,72) и среднюю и медианную абсолютные ошибки 6,29 и 4,4 месяца, соответственно ( рис. 2f ). Интересно, что модель с несколькими тканями предсказывала, что возраст одной клетки в каждой группе близок к максимальному возрасту, который мы обозначили при запуске алгоритма. Мы интерпретируем эти наблюдения как траекторию ускоренного старения (т.е. ускоренного старения) некоторых клеток из популяции, что еще больше подчеркивает гетерогенность эпигенетического старения в отдельных клетках. Удаление обоих выбросов в моделях печени и нескольких тканей привело к значительному повышению точности прогноза со значениями r Пирсона 0,95 и 0,9 соответственно ( рис. S4 ).

Рисунок S3:Показатели корреляции и регрессии различаются между наборами обучающих данных Распределение коэффициента Пирсона r (a) и коэффициентов линейной регрессии (b) для наборов обучающих данных для печени и мультитканевого. Минимальный и максимальный коэффициенты Пирсона r (c) и линейной регрессии (d) для наборов данных тренировки печени и нескольких тканей. Связь между наборами обучающих данных мультитканевым и печени Pearson r (e) и коэффициентами линейной регрессии (f) . 

Рисунок S4:Точность прогнозирования масштабов повышается с удалением выбросов Прогнозы эпигенетического возраста для гепатоцитов печени с удалением одного выброса (ускоренное старение) на группу (SRR3136664 для молодых и SRR3136629 для старых) для моделей scAge печени (a), и мультитканевой (b) . 

Интересно, что прогностические метрики этих двух моделей по данным печени варьировались в зависимости от количества CpG, включенных в расчет общего правдоподобия, в результате чего включение слишком малого или слишком большого количества CpG приводило к снижению точности предсказания ( рис. S5 ). Когда использовалось слишком мало CpG, было недостаточно индивидуальных вероятностей для расчета точного прогноза возраста ( рис. S5a-b ). Однако включение слишком большого количества CpG также привело к небольшому снижению точности прогнозов моделей ( рис. S5c-d). Поскольку наш алгоритм ранжировал CpG на основе того, как они соотносятся с возрастом, мы предлагаем, чтобы включение большего количества CpG с более низким рейтингом вносило шум в прогноз, тем самым снижая общую точность. Следует отметить, что точность прогнозов не показала значимой связи с количеством общих CpG между любой отдельной клеткой и обучающим набором данных ( рис. S6 ). Это означает, что наш метод устойчив к относительно низкому охвату отдельных клеток.

Рисунок S5: Количество CpG, профилированных в scAge, влияет на прогнозные показатели Прогностические показатели SCAge (MeanAE: средняя абсолютная ошибка, r: коэффициент корреляции Пирсона, rho: коэффициент корреляции Спирмена) для гепатоцитов варьируются в зависимости от количества CpG, включенных в алгоритм. Увеличение CpG, профилированных с 1 до 100 с шагом 5, обычно улучшает точность прогноза с включенными выбросами (а) или с удаленными выбросами (б) . Увеличение профилей CpG до 10000 на клетку с шагом 500 показывает, что промежуточное количество CpG приводит к наивысшей точности прогноза, как с включенными выбросами (c), так и с удаленными выбросами (d) .    

Рисунок S6: Покрытие CpG оказывает минимальное влияние на точность прогнозов Связь между абсолютным возрастным отклонением (абсолютное значение разницы между прогнозируемым возрастом в отдельной клетке и хронологическим возрастом ткани происхождения) и количеством обычных одноклеточных / массовых CpG с использованием часов scAge печени с выбросами (a) или с двумя удаленными выбросами (b) и с использованием часов шкалы scAge для нескольких тканей с выбросами (c) или с удаленными выбросами (d).  

Часы SCAge предсказывают, что возраст эмбриональных фибробластов близок к нулю

Мы также применили scAge к 5 эмбриональным фибробластам мыши (MEF), включенным в тот же набор данных. MEF имели значительно более высокий охват, чем гепатоциты, благодаря улучшенному качеству ДНК, которое стало результатом более мягкого процесса выделения по сравнению с клетками печени ( рис. S2a ) ( Gravina et al., 2016 ). Кроме того, среднее метилирование в MEF было ниже, чем у гепатоцитов ( рис. 2b ). scAge, обученный либо на печени, либо на наборах данных с несколькими тканями, предсказал, что эпигенетический возраст MEF будет около 0 ( рис. 2g-h). Несмотря на то, что эти клетки находятся в культуре, оказалось, что они сохраняют эпигенетическую информацию о возрасте эмбриона. В целом, наши результаты показывают, что scAge, обученный на наборе данных печени или нескольких тканей, может точно воспроизводить хронологический возраст ткани происхождения в отдельных гепатоцитах и ​​эмбриональных фибробластах.

Мышечные стволовые клетки демонстрируют минимальное эпигенетическое старение

Для дальнейшего изучения применимости scAge мы применили его к данным о молодых и старых мышечных стволовых клетках ( Hernando-Herraez et al., 2019 ). Этот набор данных состоял из 275 отдельных клеток от 6 доноров, в том числе 4 молодых (1,5 месяца) и 2 старых животных (26 месяцев). Из-за технической вариабельности методологии scBS только 185 клеток (67%) имели более 1 миллиона покрытых CpG ( рис. S2b ). Среднее метилирование между молодыми и старыми клетками было сопоставимым.

Когда мы применили к этим мышечным стволовым клеткам тот же мультитканевый scAge, который профилирует 2000 CpG, эпигенетический возраст молодых клеток составил в среднем 9,5 недель, что примерно соответствует их хронологическому возрасту. Интересно, что старые мышечные стволовые клетки показали значительное эпигенетическое увеличение возраста, но всего на несколько недель, со средним прогнозируемым возрастом 18,3 недели ( рис. 3a-b ). Эти результаты согласуются с предыдущим анализом, в котором изучался эпигенетический возраст этих клеток с помощью подхода псевдо-массового группирования с использованием мышечных часов, обученных с помощью обычных методов эластичной сети ( Hernando-Herraez et al., 2019 ; Reizel et al., 2015 ; Stubbs и др., 2017). В целом, наши результаты согласуются с ранее сообщенной динамикой эпигенетического старения мышечных стволовых клеток мышей, но дают разрешение данных на уровне отдельной клетки.

Единичные эмбриональные стволовые клетки демонстрируют низкий эпигенетический возраст

Затем мы попытались оценить scAge на наиболее распространенном типе общедоступных наборов данных о метилировании отдельных клеток: профилирующих эмбриональную ткань. Эмбриональные стволовые клетки (ESC) и их аналоги на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC) обычно показывают очень низкий прогнозируемый эпигенетический возраст, стремящийся к 0 ( Horvath, 2013 ; Meer et al., 2018 ; Petkovich et al., 2017 ). Чтобы проверить нашу модель, мы изучили 3 набора данных об эмбриональных стволовых клетках и родственных тканях ( Angermueller et al., 2016 ; Clark et al., 2018 ; Smallwood et al., 2014 ). Клетки из этих исследований показали переменный охват, и мы выборочно отфильтровали

 те клетки, в которых было охвачено не менее 1 миллиона CpG, чтобы улучшить согласованность между наборами данных (Рис. S2c ). Важно отметить, что ESC культивировали либо в традиционных условиях сыворотки, либо в бессывороточной среде с добавлением коктейля «2i» ингибиторов MEK и GSK3β. Ранее было показано, что культивирование клеток в среде 2i управляет глобальным гипометилированием в ESC, создавая эпигенетические профили, соответствующие мигрирующим примордиальным зародышевым клеткам ( Ficz et al., 2013 ).

Как и ожидалось, мы наблюдали значительное гипометилирование среди клеток 2i в исследованиях Angermueller et al.  и Smallwood et al.  ( рис. 3в ). Ооциты MII у  Smallwood et al.  показали среднее глобальное метилирование сопоставимое с клетками 2i , а эмбриоидные тела, полученных из ESC у  Clark et al.  показали в среднем наибольшее среднее метилирование, значительно выше, чем у ESC, выращенных в сыворотке и 2i ( рис. 3c ). Мы применили нашу печеночную и мультитканевую модели scAge ко всем отфильтрованным клеткам из этих трех исследований и наблюдали стабильно низкий прогнозируемый возраст для всех проанализированных типов клеток ( рис. 3d-e ). При использовании модели для печени, ESC, культивируемые в сыворотке, показали эпигенетический возраст около 0, в то время как ESC 2i показали значительно более высокий прогнозируемый эпигенетический возраст (Рис. 3г ). Однако мультитканевый предиктор возраста scAge показал противоположную тенденцию ( рис. 3e ). Кроме того, мультитканевая модель продемонстрировала большую дисперсию и более экстремальные прогнозы по сравнению с моделью печени во всех трех наборах данных. Мы предполагаем, что на мультитканевых наборах данных отображается менее устойчивая линейная зависимость от возраста, в результате чего повышенные различия в уровнях метилирования между различными тканями приводят к менее согласованным прогнозам ( рис. S3).). Эмбриоидные тельца, полученные из выращенных в сыворотке ESC, продемонстрировали более высокий возраст при использовании обоих часов, намекая на то, что инициация немодулированных сигналов дифференцировки в трех зародышевых листках быстро вызывает заметное увеличение эпигенетического возраста клеток. В целом, наши результаты предсказали, что  эпигенетический возраст эмбриональных стволовых клеток будет близок к нулю, при этом обнаружились существенные различия в зависимости от конкретных условий культивирования.

Рисунок 3:scAge выявляет четкие эпигенетические траектории старения стволовых клеток Эпигенетические прогнозы возраста мышечных стволовых клеток с использованием мультитканевых часов scAge, построенные в зависимости от хронологического возраста (а) или помещенные рядом (б) . *** обозначает p & 0,001. c) Среднее метилирование ооцитов, эмбриональных стволовых клеток (ESC) в условиях культивирования 2i или сыворотки и эмбриоидных телец. Клетки сгруппированы по исследованиям. *** означает p <0,001. Прогнозирование эпигенетического возраста для всех типов клеток в трех эмбриональных исследованиях с помощью scAge часов печени (d) или мультитканевых scAge часов (e) . ** обозначает p & 0,01, *** обозначает p <0,001. 

Анализ отдельных клеток предполагает событие омоложения во время гаструляции у мыши.

Затем мы исследовали набор данных, профилирующий гаструляцию у мышей при отдельноклеточном разрешении ( Argelaguet et al., 2019 ). Эти данные состояли из 758 отдельных клеток, выделенных из эмбрионов мышей по времени  (E) от 4,5 до 7,5 эмбриональных дней. Мы отфильтровали данные, чтобы сохранить клетки с охватом не менее 500 000 CpG, в результате чего получили окончательный набор данных из 495 клеток ( рис. S2d ). Интересно, что среднее глобальное метилирование сильно варьировало во время этого раннего периода гаструляции мышей, при этом клетки E4.5 обнаруживают значительное гипометилирование по сравнению с остальными тремя стадиями развития ( Рис. 4a ). Эта тенденция глобального метилирования указывает на связь между ESC, выращенными в условиях 2i, и клетками  эмбрионов E4.5.

Рисунок 4: SCAge предполагает событие омоложения во время гаструляции а) Среднее метилирование среди клеток E4.5 - E7.5. *** означает p <0,001. Прогнозирование эпигенетического возраста для отдельных эмбриональных клеток на протяжении гаструляции с помощью scAge часов печени (b) и мультитканевых scAge часов (c) . ** обозначает p <0,01, *** обозначает p <0,001.  

Недавно было высказано предположение, что эмбриогенез может характеризоваться начальным снижением биологического возраста до точки, называемой «нулевой точкой», после чего формально начинается старение организма ( Гладышев, 2021 ). В соответствии с этой идеей недавнее применение эпигенетических часов к массивным образцам выявило значительное снижение биологического возраста (т.е. омоложение) на ранних стадиях эмбриогенеза с последующим увеличением на более поздних стадиях ( Kerepesi et al., 2021 ). Это открытие также согласуется с представлением о том, что накопление повреждений неизбежно происходит в течение жизни организма, даже в половых клетках. Таким образом, считается, что событие омоложения происходит в середине эмбриогенеза, чтобы обеспечить непрерывное воспроизводство новых биологически молодых особей.

Чтобы исследовать эту идею на уровне отдельных клеток, мы применили scAge часы  печени  и мультитканевые к отдельным эмбриональным клеткам на четырех исследуемых стадиях развития. scAge часы печени показали устойчивое и значительное снижение среднего прогнозируемого возраста в период от E4,5 до E7,5, причем последнее значение возраста было около 0 ( рис. 4b ). Мультитканевые scAge часы  показали идентичную тенденцию, хотя и с несколько повышенным и более изменчивым прогнозируемым возрастом ( рис. 4c).). Вместе эти результаты показывают, что событие омоложения происходит в середине эмбриогенеза и что отдельные клетки могут быть омоложены естественными способами. Примечательно, что самый низкий эпигенетический возраст единичных клеток приблизительно соответствует стадии гаструляции и связан с гиперметилированием, предполагая, что для омоложения клеток важно как деметилировать, так и впоследствии реметилировать геном.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этой работе мы представляем scAge, вероятностную модель для определения эпигенетического возраста отдельных клеток. Наш метод использует данные о массовом метилировании для обучения моделей линейной регрессии, которые предсказывают уровни метилирования, учитывая исключительно возраст в качестве входных данных. На основе этих одномерных моделей мы вычисляем апостериорную вероятность наблюдения неметилированного или метилированного состояния в отдельной клетке. Используя выбранную фракцию возрастных CpG и связанных с ними вероятностей, мы вычисляем вероятность того, что клетка происходит из ткани определенного хронологического возраста, и регистрируем возраст максимальной вероятности в качестве конечного предиктора эпигенетического возраста. Этот подход решает проблемы разреженности и неравномерного покрытия профилей метилирования отдельных клеток, что препятствует попыткам оценки эпигенетического возраста в отдельных клетках. Действительно, все предыдущие эпигенетические часы требуют определенных наборов сайтов CpG для их применения, что невозможно в случае одиночных клеток.

Этот метод позволяет точно прогнозировать возраст отдельных гепатоцитов и эмбриональных фибробластов мыши с высоким разрешением на моделях, обученных либо на печени, либо на мультитканевых наборах данных. Кроме того, мы демонстрируем согласованность между нашей моделью и предыдущей работой со стволовыми клетками мышей, которые демонстрируют ослабленное эпигенетическое старение по сравнению с их хронологическим возрастом. Мы также обнаружили, что, хотя, ESC обычно имеют низкий эпигенетический возраст, возраст различается в зависимости от условий культивирования. Наконец, наши данные предоставляют дополнительное доказательство гипотезы старения «нулевой точки», показывая очень значимое и устойчивое снижение эпигенетического возраста отдельных клеток во время гаструляции.

Несмотря на прогресс в эпигенетическом профилировании возраста отдельных клеток, существуют различные возможности для улучшения. Во-первых, здесь предполагалось, что состояния бинарного метилирования CpG независимы друг от друга, поскольку в предыдущих работах говорилось, что при анализе единичных чтений из совокупных образцов это имело место ( Han, Franzen, et al., 2020 ; Han, Nikolić, et al. др., 2020). Однако более тщательный анализ этого поведения, особенно в отдельных клетках, может выявить биологические идеи, предполагающие более сложные отношения. Кроме того, использование только линейной регрессии может быть неоптимальным при рассмотрении потенциально разнообразного набора математических ассоциаций, которые лучше всего моделируют уровни метилирования CpG и возраст. Наконец, остается исследовать, как индивидуальные траектории старения клеток меняются со временем и как они передаются во время таких событий, как деление клеток.

Взятые вместе, эти результаты предполагают драматические последствия в отношении эпигенетического старения. Мы обнаружили, что совокупность нескольких прогнозов по отдельным клеткам дает точный средний показатель возраста конкретной ткани. Однако этот одноклеточный подход одновременно обнаруживает глубокую неоднородность траекторий старения отдельных клеток. Это говорит о том, что все клетки в ткани стареют, но часы, вероятно, тикают независимо в пределах одной клетки. В свою очередь, мы предполагаем, что некоторые клетки подвергаются ускоренному или замедленному эпигенетическому старению, что ранее было невозможно установить ( рис. 5а).). Кроме того, этот метод может найти широкое клиническое применение для человеческих соматических, зародышевых и раковых клеток, поскольку с помощью этого подхода можно различать и картировать «молодые» и «старые» клетки в гетерогенной ткани ( рис. 5b ). В целом, мы представляем здесь первый метод определения эпигенетического возраста в отдельных клетках с далеко идущим потенциалом во всем что касается старения.

Рисунок 5: Модели старения в отдельных клетках а) Схематическая модель траекторий старения одиночных клеток. Некоторые клетки (красные) показывают ускоренное эпигенетическое старение, в то время как другие клетки (синие) показывают замедленное эпигенетическое старение по сравнению с эталонной популяцией клеток (зеленый). б) Схематическое изображение неоднородности эпигенетического старения в популяции клеток, которая состоит из клеток с ускоренной (красный), замедленной (синий) и средней (зеленый) траекториями старения.  

МЕТОДЫ

Обработка данных отдельных клеток

Для Gravina et al. данные секвенирования были загружены из SRA под регистрационным номером SRA344045 ( Gravina et al., 2016 ). В этом случае данные секвенирования были предварительно обрезаны перед нанесением на SRA. Обрезанные последовательности были сопоставлены с геномом mm10 / GRCm38.p6 с использованием Bismark v0.22.3 с опцией - non_directional , как это было предложено в Руководстве пользователя Bismark v0.21.0 для препаратов библиотеки Zymo Pico-Methyl scWGBS. Чтения были дедуплицированы, а уровни метилирования для сайтов CpG были извлечены с помощью Bismark ( Krueger & Andrews, 2011 ).

Для Hernando-Herraez et al., Angermueller et al., Clark et al., Smallwood et al. И Argelaguet et al. исследований, обработанные файлы покрытия, содержащие извлеченные уровни метилирования, сгенерированные Bismark, были загружены непосредственно из базы данных GEO под номерами доступа GSE121436, GSE68642, GSE109262, GSE56879 и GSE121690, соответственно ( Angermueller et al., 2016 ; Argelaguet et al., 2019 ; Clark et al., 2018 ; Hernando-Herraez et al., 2019 ; Smallwood et al., 2014 ).

Затем все файлы покрытия были дополнительно обработаны для масштабирования уровня метилирования до соотношения между [0, 1]. Хотя профили метилирования отдельных клеток были почти полностью бинарными, технические соображения, такие как систематическая ошибка амплификации ПЦР, привели к некоторым промежуточным значениям метилирования. Неопределенные вызовы метилирования 0,5 были удалены перед последующим анализом. Оставшиеся значения метилирования округляли до 0 или 1. Геномные позиции на 19 аутосомах мыши были сохранены для анализа, чтобы частично минимизировать влияние пола на исследование. Покрытие интерпретировалось как общее количество покрытых метилированных и неметилированных цитозинов на обеих цепях ДНК. Среднее метилирование в отдельных клетках вычисляли как среднее всех наблюдаемых состояний бинарного метилирования.

Массовая обработка данных

Чтобы создать массивные эталонные наборы данных для оценки линейной зависимости между возрастом и уровнем метилирования, мы загрузили обработанные данные RRBS исследования Thompson et al. , депонированные в базе данных GEO под инвентарным номером GSE120132 ( Thompson et al., 2018). Этот набор данных состоял из 549 полных образцов из печени, легких, крови, почек, жировой и мышечной тканей в возрасте от 1 месяца до 21 месяца. Фракции метилирования были приняты как число прочтений, подтверждающих метилированный статус для CpG, по сравнению с общим числом чтений, которые покрывают этот CpG. Чтобы максимизировать точность уровней массового метилирования при одновременном сохранении как можно большего количества сайтов, были сохранены только сайты CpG, для которых 90% образцов имели как минимум 5-кратное покрытие. Это привело к окончательной мульти-тканевой матрице из 549 образцов 748 955 положительных цепей CpG (только аутосомные хромосомы) с некоторыми пропущенными значениями. Отсюда была создана отдельная матрица только для печени, содержащая 60 образцов печени с возрастом от 2 до 20 месяцев на основе того же набора из 748 955 CpG. Корреляции Пирсона с возрастом рассчитывались с использованиемcorrwith из пакета pandas . Линейные регрессии были рассчитаны с использованием функции LinearRegression как части пакета sklearn .

Вероятностные одноклеточные часы

На разработку алгоритма для определения эпигенетического возраста отдельных клеток нас вдохновила недавняя работа лаборатории Вагнера по анализу возраста при секвенировании отдельных бисульфитных ампликонов со штрих-кодом (BBA-seq), считанных из массивных образцов ( Han, Franzen, et al. , 2020 ; Хан, Николич и др., 2020 ). Сначала мы вычислили линейные регрессии для каждой CpG, включенной в обучающий набор данных, в форме:  где возраст в месяцах - независимая переменная, f CpG ( возраст ) - прогнозируемый средний уровень метилирования, а a и b - коэффициент линейной регрессии и точка пересечения, соответственно ( Fig. 1c ). Мы также рассчитали коэффициент корреляции Пирсона с возрастом для каждого CpG в обучающей выборке.

Затем мы сопоставили CpG, включенные в набор обучающих данных, с CpG в любой данной отдельной клетке, получив серию из n CpG, которые присутствуют как в групповых, так и в индивидуальных профилях отдельных клеток ( рис. 1d ). Мы отфильтровали эти n CpG на основе абсолютного значения их корреляции с возрастом, выбрав (в модели печени) 700 CpG с наибольшей абсолютной корреляцией Пирсона и (в модели с множеством тканей) 2000 CpG с наибольшей абсолютной корреляцией Пирсона. . Это количество CpG для включения в каждую модель было определено in silico.на основе тех, которые генерировали наиболее оптимальные метрики точности с использованием Gravina et al. набор данных в качестве ориентира. Следует отметить, что можно использовать различное количество CpG с минимальными колебаниями в эпигенетических прогнозах возраста ( рис. S5 ).

Для каждого выбранного CpG в клетке мы перебирали возраст с шагом 0,1 месяца от минимального возраста до максимального параметра возраста. Используя формулу линейной регрессии, рассчитанную для отдельного CpG, мы вычислили f CpG ( возраст ), который обычно находится в диапазоне от 0 до 1. Если это значение лежит за пределами диапазона (0, 1), оно вместо этого заменяется на 0,001 или 0,999 в зависимости от близости к любому значению. Далее мы предполагаем, что вероятность наблюдения метилированной одиночной клетки, происходящей из ткани данного возраста, приблизительно равна f CpG ( age ), то есть Pr CpG ( age ) = f CpG ( age).). Тогда вероятность того, что одна клетка метилирована в этом CpG, равна Pr CpG ( age ), и наоборот, вероятность того, что одна клетка не метилирована в этом CpG, равна 1 - Pr CpG ( age ). Это обеспечивает зависящую от возраста вероятность P для каждого общего CpG, сохраненного в алгоритме ( рис. 1e ).

Произведение каждой из этих вероятностей будет общей вероятностью наблюдаемого паттерна метилирования:  где k представляет собой отдельные CpG. Наша цель - найти максимум этого продукта среди разных возрастов (т.е. найти наиболее вероятный возраст для наблюдения этого конкретного паттерна метилирования). Для этого мы взяли сумму по CpG логарифма вероятностей (чтобы избежать ошибок потери значимости во время вычислений). Это дает нам  для каждой возрастной ступени. Эти логарифмические суммы обеспечивают показатель вероятности для каждого возраста, когда одна клетка происходит из основной ткани этого возраста. Наконец, мы выбираем возраст максимального правдоподобия в качестве предиктора возраста для одной клетки.

Вычислительный и статистический анализ

Все анализы проводились с использованием Python 3.8.3 со стандартным набором научных, математических и графических пакетов. Для обработки данных секвенирования использовались собственные сценарии bash. Для выполнения всех статистических тестов использовался t-критерий Велча, предполагающий неравные дисперсии. P-значения менее 0,05 были приняты как значимые. * Обозначает p <0,05, ** обозначает p <0,01, а *** обозначает p <0,001.

ВКЛАД АВТОРА

AT выполнил все анализы. AT и CK разработали метод и реализовали алгоритм. CK внесла свой вклад в предварительную обработку данных. AT и VNG написали рукопись при участии CK. Компания VNG разработала исследование и руководила работой.

НАЛИЧИЕ КОДА

Исходный код scAge будет доступен после публикации.

КОНКУРИРУЮЩИЕ ИНТЕРЕСЫ

AT, CK и VNG названы изобретателями в предварительной заявке на патент на scAge.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Тиамат Фокс и Адит Гангули за помощь со схематическими изображениями. Мы также благодарим Марко Мариотти, Анастасию Шиндьяпину, Сун Хи Йим, Санг-Гу Ли, Дидака Сантесмассеса и Патрика Гриффина за полезное обсуждение. Поддерживается грантами NIA для VNG.

Опубликовано: 15 марта 2021г.

Авторы: Александр Трапп,Чаба Керепеси,Вадим Николаевич Гладышев

Оригинальная статья: Profiling epigenetic age in single cells

Перевод Ник Сестрин

 Оригинальная статья: Multi-omic rejuvenation of human cells by maturation phase transient reprogramming

Введение

Старение - это постепенное снижение функции клеток и тканей с течением времени, которое происходит почти у всех организмов и связано с множеством молекулярных признаков, таких как истощение теломер, генетическая нестабильность, эпигенетические и транскрипционные изменения и накопление неправильно свернутых белков (López-Otín и др., 2013). Это приводит к нарушению восприятия питательных веществ, митохондриальной дисфункции и увеличению частоты клеточного старения, что влияет на общую функцию клеток, межклеточную коммуникацию, способствует истощению пулов стволовых клеток и вызывает тканевую дисфункцию (López-Otín et al., 2013). Развитие некоторых связанных со старением изменений, таких как транскриптомные и эпигенетические, можно измерить с высокой точностью, и поэтому их можно использовать для построения «часов старения», которые предсказывают хронологический возраст с высокой точностью у людей (Fleischer et al., 2018; Hannum et al., 2013; Horvath, 2013; Peters et al., 2015) и у других млекопитающих (Stubbs et al., 2017; Thompson et al., 2017, 2018). Поскольку транскриптомные и эпигенетические изменения обратимы, по крайней мере в принципе, возникает интригующий вопрос о том, можно ли обратить вспять молекулярные атрибуты старения и фенотипически омолодить клетки (Rando and Chang, 2012).

Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) - это процесс, с помощью которого практически любая соматическая клетка может быть преобразована в состояние, подобное эмбриональным стволовым клеткам. Интересно, что перепрограммирование iPSC обращает вспять многие возрастные изменения, включая истощение теломер и окислительный стресс (Lapasset et al., 2011). Примечательно, что эпигенетические часы сбрасываются примерно до 0, что указывает на то, что перепрограммирование может обратить вспять эпигенетические изменения, связанные со старением (Horvath, 2013). Однако перепрограммирование iPSC также приводит к потере исходной идентичности клетки и, следовательно, к потере функции. Напротив, подходы к перепрограммированию, при которых факторы Яманака (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) экспрессируются в течение коротких периодов времени, могут быть способны достичь омоложения без потери идентичности клеток. Перепрограммирование может быть выполнено in vivo (Abad et al., 2013), и действительно, циклическая экспрессия факторов Yamanaka in vivo может увеличивать продолжительность жизни прогероидных мышей и улучшать клеточную функцию у мышей дикого типа (Ocampo et al., 2016). Альтернативный подход к перепрограммированию in vivo продемонстрировал обратимость связанных со старением изменений в ганглиозных клетках сетчатки и был способен восстанавливать зрение на модели глаукомы на мышах (Lu et al., 2020). Совсем недавно было показано, что временное перепрограммирование in vitro обращает вспять множество аспектов старения фибробластов и хондроцитов человека (Sarkar et al., 2020). Тем не менее, степень эпигенетического омоложения, достигнутая с помощью предыдущих методов частичного перепрограммирования, была умеренной (~ 3 года) по сравнению с резким скачком, достигнутым полным ИПСК перепрограммированием. Здесь мы устанавливаем новую стратегию временного перепрограммирования, при которой факторы Яманака экспрессируются до достижения фазы созревания с последующей отменой их индукции (кратковременное перепрограммирование фазы созревания, MPTR), с помощью которой мы смогли добиться надежного и очень существенного омоложения (~ 30 лет), при сохранении исходной идентичности клетки.

Полученные результаты

Кратковременно перепрограммированные клетки восстанавливают свою первоначальную клеточную идентичность

Перепрограммирование можно разделить на три фазы: инициация, созревание и стабилизация (Samavarchi-Tehrani et al., 2010) (рис. 1A). Предыдущие попытки частичного перепрограммирования проводились только на стадии инициации (Ocampo et al., 2016; Sarkar et al., 2020). Однако дальнейшее перепрограммирование, вплоть до фазы созревания, может привести к более существенному омоложению. Чтобы исследовать потенциал частичного перепрограммирования на фазе созревания (MPTR) для обращения фенотипов старения, мы создали индуцируемую доксициклином полицистронную кассету перепрограммирования, которая кодирует Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и GFP. Используя полицистронную кассету, мы могли гарантировать, что отдельные клетки способны экспрессировать все четыре фактора Яманака. Эта кассета перепрограммирования была способна генерировать независимые от доксициклина линии ИПСК из человеческих фибробластов и индуцировала значительное снижение возраста метилирования ДНК на протяжении всего процесса перепрограммирования, что согласуется с предыдущей работой с использованием другой системы перепрограммирования (Olova et al., 2018) (Рисунок 1A) . В частности, возраст метилирования ДНК, измеренный с помощью эпигенетических часов (Horvath, 2013), был существенно снижен на относительно ранней стадии  процесса перепрограммирования (для завершения которого требуется около 50 дней) с приблизительным омоложением на 20 лет к 10-му дню и 40 лет на день 17 (рис. 1А). Аналогичные результаты были получены с использованием часов кожи и крови (Horvath et al., 2018) (дополнительный рисунок 1A). Поэтому мы сосредоточились на промежутке между 10 и 17 днями, чтобы разработать наш протокол MPTR для человеческих фибробластов (рис. 1B), прогнозируя, что это позволит существенно изменить фенотипы старения, потенциально позволяя клеткам восстановить исходную клеточную идентичность. Кассету перепрограммирования вводили в фибробласты от трех доноров среднего возраста (38, 53 и 53 года) с помощью лентивирусной трансдукции перед отбором успешно трансдуцированных клеток путем сортировки на GFP. Затем мы перепрограммировали фибробласты на разное время (10, 13, 15 или 17 дней), добавив в среду 2 мкг / мл доксициклина, и провели сортировку в потоке, чтобы выделить клетки, которые успешно перепрограммировались (обозначены как «промежуточный продукт кратковременного перепрограммирования»: SSEA4 положительный, CD13 отрицательный), а также клетки, которые не смогли перепрограммироваться (помеченные как «неудачный  промежуточный продукт кратковременного перепрограммирования»: CD13 положительный, SSEA4 отрицательный). На этом этапе примерно 25% клеток успешно перепрограммировались, и примерно 35% клеток не могли перепрограммироваться, в то время как остальные были дважды положительными или дважды отрицательными (дополнительный рисунок 1B). Клетки собирали на матрицу метилирования ДНК или РНК-seq, а также повторно высевали для дальнейшего культивирования в отсутствие доксициклина, чтобы остановить экспрессию кассеты перепрограммирования. Дальнейшее культивирование в отсутствие доксициклина генерировало «кратковременно перепрограммированные фибробласты», которые ранее экспрессировали SSEA4 на промежуточной стадии, а также «не сумевшие перепрограммироваться фибробласты», которые экспрессировали кассету перепрограммирования (были GFP-положительными), но не экспрессировали SSEA4. В качестве отрицательного контроля мы одновременно берем «якобы инфицированные» популяции фибробластов от одних и тех же доноров. Эти клетки прошли первоначальную потоковую сортировку на жизнеспособность (для учета эффектов сортировки по GFP) перед культивированием в тех же условиях, что и перепрограммируемые клетки, и потоковую сортировку  на CD13 (клетки, собранные на этой стадии, генерировали «промежуточный продукт отрицательного контроля» для метиломного  и транскриптомного анализов). Наконец, эти «промежуточные отрицательные контрольные клетки» выращивали в отсутствие доксициклина в течение того же периода времени, что и экспериментальные образцы, чтобы учесть эффекты расширенной клеточной культуры, генерирующие «отрицательные контрольные фибробласты» (рис. 1В).

Рисунок 1. Кратковременно перепрограммированные клетки снова обретают свою первоначальную клеточную идентичность.   (A) Средний возраст метилирования ДНК (рассчитанный с использованием мульти-тканевых часов (Horvath, 2013)) на протяжении всего процесса перепрограммирования, когда клетки трансдуцировались нашим вектором tetO-GFP-hOKMS и непрерывно обрабатывались 2 мкг / мл доксициклина. Перепрограммирование делится на три отдельные фазы: фаза инициации (IP); фаза созревания (MP) и фаза стабилизации (SP). Возраст метилирования ДНК существенно снизился во время фазы созревания перепрограммирования в клетках, которые были успешно перепрограммированы (пурпурная линия), но не в контрольных клетках (желтые и оранжевые линии представляют нетрансдуцированные клетки и клетки, экспрессирующие hOKMS, но не сумевшие перепрограммироваться, как указано маркерами клеточной поверхности. , соответственно). Точки представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. N = 3 биологических повтора для каждого состояния, когда фибробласты были получены от разных доноров. N = 2 биологических повтора для временной точки ИПСК (день 51).   (B) Экспериментальная схема для фазы созревания кратковременного перепрограммирования (MPTR). Перепрограммирующую конструкцию tetO-GFP-hOKMS вводили в фибробласты от старых доноров с помощью лентивирусной трансдукции. В качестве альтернативы клетки были «ложно инфицированы» в качестве отрицательного контроля. После этого клетки выращивали в присутствии 2 мкг / мл доксициклина для инициации перепрограммирования. В некоторые моменты времени во время фазы созревания клетки были отсортированы в потоке и успешно перепрограммированые клетки (CD13-SSEA4 +), и клетки, которые не смогли перепрограммироваться (CD13 + SSEA4-), были собраны для анализа. Они было названы «промежуточным продуктом кратковременного перепрограммирования» и «промежуточным продуктом неудачного перепрограммирования» соответственно. Отсортированные клетки также дополнительно культивировали и выращивали в отсутствие доксициклина в течение по крайней мере четырех недель - это было названо «кратковременно перепрограммированные» (CD13-SSEA4 +) или «не удалось перепрограммировать» (CD13 + SSEA4-).(C) Фазово-контрастные микроскопические изображения клеток после обработки доксициклином (промежуточный продуктом кратковременного перепрограммирования) и после отмены доксициклина (кратковременно перепрограммированные), как описано в B. Морфология некоторых клеток изменилась после обработки доксициклином. Эти клетки, по-видимому, образовывали колонии, которые становились больше при более длительном воздействии доксициклина. После сортировки эти клетки культивировали в среде, больше не содержащей доксициклин, и оказалось, что они вернулись к своей первоначальной морфологии фибробластов.  (D) Анализ основных компонентов транскриптомов образцов кратковременно перепрограммированных и эталонных перепрограммированных образцов (от светло-синего до темно-синего, данные Banovich et al (2018), Fleischer et al (2018) и наш новый набор данных перепрограммирования Sendai). Контрольные образцы образуют траекторию перепрограммирования вдоль ПК1. В начале этой траектории находились временно перепрограммированные образцы и контрольные образцы.(E) Средние уровни экспрессии гена, специфичного для фибробластов, FSP1 и гена, специфичного для ИПСК, NANOG. Кратковременно перепрограммированные образцы экспрессировали эти гены на уровнях, аналогичных контрольным фибробластам. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Образцы, временно перепрограммированные в течение 13, 15 или 17 дней, объединяли. В скобках указано количество образцов в каждой группе.(F) Анализ основных компонентов временного перепрограммирования (пурпурные точки) и эталонных метиломов перепрограммированных образцов (от светло-синего до темно-синего, данные Banovich et al (2018), Ohnuki et al (2014) и наш новый набор данных перепрограммирования Sendai). Контрольные образцы формировали траекторию перепрограммирования вдоль ПК1. Образцы временного перепрограммирования перемещались по этой траектории при продолжающемся воздействии доксициклина (светло-пурпурные точки) и возвращались к началу траектории после изъятия доксициклина (пурпурные точки). Контрольные образцы (желтые и оранжевые точки) оставались в начале траектории на протяжении всего эксперимента.(G) Средние уровни метилирования ДНК в специфическом для фибробласта гене FSP1 и в специфическом для ИПСК гене POU5F1 (кодирующем OCT4). Кратковременно перепрограммированные образцы имели профили метилирования по этим генам, которые напоминают профили, обнаруженные в фибробластах. Серые полосы и черные полосы показывают расположение аннотированных промоторов и генов Ensembl, соответственно. Образцы, временно перепрограммированные на 10, 13, 15 или 17 дней, были объединены для визуализации. В скобках указано количество образцов в каждой группе.

После перепрограммирования в течение 10-17 дней мы обнаружили, что фибробласты претерпели резкие изменения морфологии. При визуальном осмотре с использованием светового микроскопа выяснилось, что клетки претерпели переход от мезенхимы к эпителию и образовали колонии, которые постепенно становились больше с более длительными периодами перепрограммирования, что согласуется с появлением раннего маркера плюрипотентности SSEA4. После сортировки клеток и культивирования в отсутствие доксициклина мы обнаружили, что они смогли вернуться к своей первоначальной морфологии фибробластов, показывая, что морфологическая реверсия возможна даже после 17 дней перепрограммирования (рис. 1C). Мы дополнительно исследовали идентичность клеток после этого MPTR путем проведения анализа массива метилирования ДНК и секвенирования РНК для изучения их метиломов и транскриптомов, соответственно. Мы включили опубликованные наборы данных перепрограммирования в наш анализ, а также новый набор данных перепрограммирования, который мы создали на основе доставки вирусом Sendai факторов Яманака, чтобы использовать в качестве референсного образца (Banovich et al., 2018; Fleischer et al., 2018; Ohnuki et al. ., 2014). Анализ главных компонент  значений экспрессии всех генов в транскриптоме разделил  клетки по степени перепрограммирования, и контрольные наборы данных сформировали траекторию перепрограммирования вдоль PC1 (рис. 1D). Кратковременно перепрограммированные образцы группируются в начале этой траектории, показывая, что эти образцы транскрипционно напоминают фибробласты, а не промежуточные продукты перепрограммирования или ИПСК (рис. 1D). Например, кратковременно перепрограммированные клетки не экспрессировали маркер плюрипотентности NANOG и экспрессировали высокие уровни маркера фибробластов FSP1 (рис. 1E). Аналогичным образом, анализ главных компонент метиломов  разделил клетки по степени перепрограммирования, и контрольные наборы данных сформировали траекторию перепрограммирования. Действительно, промежуточные образцы из нашего эксперимента по кратковременному перепрограммированию (собранные после фазы перепрограммирования, но до фазы реверсии) сгруппировались вдоль этой траектории перепрограммирования (рис. 1F), показывая, что клетки эпигенетически движутся в сторону плюрипотентности, соответствующей потере поверхностного маркера фибробластов CD13 и увеличению поверхностного маркера ИПСК SSEA4. Примечательно, что кратковременно перепрограммированные образцы вернулись к началу этой траектории (с референсными образцами фибробластов), обнаружив, что они снова эпигенетически напоминают фибробласты. Мы обнаружили, что типичные области, которые изменяются во время перепрограммирования, возвращаются к фибробластоподобным состояниям (Takahashi et al., 2007), такие как гиперметилирование промотора OCT4 и гипометилирование промотора FSP1 в наших временно перепрограммированных клетках (рис. 1G). Вместе эти данные демонстрируют, что фибробласты могут временно перепрограммироваться до фазы созревания и затем возвращаться в состояние, которое морфологически, эпигенетически и транскрипционно сходно с идентичностью исходной клетки. Насколько нам известно, это первый метод кратковременного перепрограммирования фазы созревания, при котором факторы Яманака временно экспрессируются вплоть до фазы созревания перепрограммирования, прежде чем экспрессия факторов отменяется.

Память о метилировании энхансеров сохраняется на промежуточном этапе кратковременного перепрограммирования.

Хотя кратковременно перепрограммированные фибробласты временно утратили свою клеточную идентичность (становясь SSEA4-положительными), они смогли повторно приобрести ее после удаления факторов перепрограммирования, что позволяет предположить, что они сохранили память о своей первоначальной клеточной идентичности. Мы предположили, что это, возможно, форма эпигенетической памяти, и поэтому исследовали уровни метилирования ДНК в промоторах и энхансерах во время процесса перепрограммирования. Мы использовали Ensembl Regulatory Build, чтобы получить расположение промоторов и энхансеров, а также статус их активности в дермальных фибробластах и ИПСК. Мы сосредоточились на промоторах и энхансерах, которые активны в фибробластах, но больше не активны в ИПСК, и классифицировали их как промоторы и энхансеры, специфичные для фибробластов (рис. 2А, В, нижние панели). В целом, мы обнаружили, что уровни метилирования ДНК были относительно низкими на промоторах, специфичных для фибробластов, даже в ИПСК (рис. 2А), за исключением небольшого подмножества промоторов (14 из 479), которые стали гиперметилированными во время перепрограммирования, но все еще были слабо метилированы в промежуточный этап кратковременного перепрограммирования. Эти промоторы могут давать некоторую память о начальном типе клеток, но они явно не связаны с функцией фибробластов (рис. 2А). Таким образом, метилирование промоторной ДНК вряд ли является источником существенной памяти об идентичности фибробластов. Напротив, мы обнаружили, что метилирование ДНК было относительно динамичным на фибробласт-специфичных энхансерах. Примерно половина всех фибробласт-специфичных энхансеров (2351 из 4204) приобретает метилирование ДНК во время перепрограммирования в ИПСК. Однако даже на 17 день процесса перепрограммирования (самый продолжительный срок перепрограммирования, протестированный здесь), эти энхансеры все еще оставались деметилированными (рис. 2В). Мы также сравнили метилирование этих энхансеров в наших промежуточных и конечных образцах с референсными наборами данных с использованием PCA. Образцы остаются фибробластоподобными на этих энхансерах примерно до 20 дня перепрограммирования, когда начинается фаза стабилизации (рис. 2C), в отличие от метилома в целом (рис. 1F). Таким образом, в целом эти энхансеры, вероятно, будут оставаться в равновесии во время кратковременного перепрограммирования и в результате могут действовать как источник памяти о первоначальной идентичности клеток в то время, когда программа соматической транскрипции репрессируется и соматические белки, такие как CD13, теряются (Дэвид и Поло, 2014).

Рисунок 2. Эпигенетическая память на энхансерах может позволить клеткам вернуться к своей исходной идентичности.(A) Тепловая карта (верхняя панель), исследующая уровни метилирования ДНК фибробласт-специфичных промоторов в клетках до (светло-синяя группа), во время (светло-пурпурная группа, промежуточные клетки с кратковременным перепрограммированием, определенные на рисунке 1B) и после (пурпурная группа, кратковременно перепрограммированные фибробласты, определенные на рисунке 1B), кратковременное перепрограммирование, а также в ИПСК (темно-синяя группа). Каждый образец был нанесен на график как отдельный столбец, независимо от того, перепрограммирован ли он в течение 10, 13, 15 или 17 дней. Промоторы фибробластов в значительной степени остаются деметилированными во время полного перепрограммирования и на промежуточных стадиях кратковременного перепрограммирования. Промоторы, специфичные для фибробластов, были определены как промоторы, которые активны в фибробластах, но больше не активны в ИПСК, на основании аннотаций регуляторных построений Ensembl (становятся неактивными, колеблющимися или репрессированными). Это происходит только в небольшом подмножестве промоторов, которые активны в фибробластах, как показано на круговой диаграмме (545 из 7910; нижняя панель).(B) Тепловая карта (верхняя панель), изучающая уровни метилирования ДНК фибробласт-специфичных энхансеров в клетках до (светло-синяя группа), во время (светло-пурпурная группа) и после (пурпурная группа) временного репрограммирования, а также в ИПСК (темно-синяя группа) ). Каждый образец был нанесен на график как отдельный столбец, независимо от того, перепрограммирован ли он на 10, 13, 15 или 17 дней. Энхансеры фибробластов становились гиперметилированными во время полного репрограммирования, но все еще деметилировались на промежуточных стадиях временного репрограммирования. Специфичные для фибробластов энхансеры были определены как энхансеры, которые активны в фибробластах, но больше не активны в ИПСК (становятся неактивными, уравновешенными или репрессированными) на основе аннотаций регуляторных построений Ensembl. Это происходит с большинством энхансеров, которые активны в фибробластах, как показано на круговой диаграмме (13831 из 16026; нижняя панель).(C) Анализ основных компонентов данных метилирования от временного репрограммирования (пурпурные точки) и эталонных образцов репрограммирования на фибробласт-специфичных энхансерах (от светло-синего до темно-синего, данные Banovich et al (2018), Ohnuki et al (2014) и наш роман Набор данных перепрограммирования Сендай). Контрольные образцы формировали траекторию перепрограммирования вдоль ПК1. Промежуточные образцы с временным перепрограммированием и образцы с временным перепрограммированием тесно группируются с фибробластами вдоль PC1.   

Временное перепрограммирование обращает вспять возрастные изменения транскриптома

Чтобы исследовать влияние MPTR на транскриптом старения, мы обучили предиктор транскрипционного возраста, используя регрессию методом случайного леса  на опубликованных данных фибробластов РНК-seq от доноров в возрасте от 1 до 94 лет (Fleischer et al., 2018). Предиктор транскрипционного возраста был обучен на трансформированном возрасте, подобно эпигенетическим часам Хорвата, для учета ускоренного созревания в детстве и подростковом возрасте (Horvath, 2013). Окончательный предиктор возраста транскрипции имел среднюю абсолютную ошибку 13,5 лет, причем эта ошибка была выше, чем ошибка эпигенетических часов, согласующихся с предыдущими предикторами транскрипционного возраста (Fleischer et al., 2018; Peters et al., 2015). Используя наш предиктор, мы обнаружили, что кратковременное перепрограммирование снижает возраст транскрипции примерно на 30 лет и что все исследованные времена перепрограммирования MPTR были способны уменьшать возраст транскрипции в аналогичной степени. Мы также наблюдали умеренное снижение возраста транскрипции в клетках, которые не смогли временно перепрограммировать (SSEA4 отрицательный в промежуточный момент времени), предполагая, что экспрессия только факторов перепрограммирования способна омолаживать некоторые аспекты транскриптома (рис. 3А). Это снижение транскрипционного возраста значительно больше, чем недавно достигнутое с помощью временной трансфекции факторов Яманака (Sarkar et al., 2020), что, согласно нашему предиктору транскрипционного возраста (дополнительный рисунок 2A), составило примерно 10 лет, что соответствует нашему подходу перепрограммирования далее в фазу созревания, а не только до конца фазы инициации. Чтобы изучить это транскриптомное омоложение более подробно, мы идентифицировали гены, которые значительно коррелировали с возрастом в эталонном наборе данных о старении фибробластов (Fleischer et al., 2018), и использовали эти гены для проведения анализа основных компонентов (3707 генов). Образцы, в основном разделенные по возрасту, и контрольные образцы фибробластов формировали траекторию старения. Кратковременно перепрограммированные образцы сгруппированы ближе к молодым фибробластам вдоль PC1, чем образцы отрицательного контроля, что дополнительно подтверждает выводы нашего предиктора транскрипционного возраста, что MPTR омолаживает транскриптом (рис. 3B).

Рисунок 3. Кратковременное перепрограммирование обращает вспять возрастные изменения транскриптома.   (A) Средний транскрипционный возраст, рассчитанный с использованием адаптированных часов транскриптома (средняя абсолютная ошибка = 13,5 лет) для образцов отрицательного контроля (желтый), образцов, которые экспрессировали OSKM, но их не удалось перепрограммировать, судя по маркерам клеточной поверхности (оранжевый) и клеток, которые были успешно ератковременно перепрограммированы (пурпурный), как показано на рисунке 1B, в течении 13, 15 или 17 дней. В скобках указано количество образцов в каждой группе. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение.  (B) Анализ главных компонентов уровней экспрессии гена, связанного со старением фибробластов, при кратковременном перепрограммировании (пурпурный) и эталонных образцах стареющих фибробластов (голубой-темно-синий). Контрольные образцы формировали траекторию старения вдоль ПК1. Образцы с кратковременным перепрограммированием, расположенные ближе к молодым фибробластам, чем образцы отрицательного контроля, предполагают, что они были транскрипционно моложе.   (C) Средние уровни экспрессии всех генов в кратковременно перепрограммированных образцах по сравнению с таковыми в образцах отрицательного контроля. Кроме того, гены имеют цветовую маркировку по изменению их экспрессии с возрастом. Гены, которые активируются с возрастом, подавлялись с помощью кратковременного перепрограммирования, а гены, которые подавлялись с возрастом, активировались с помощью кратковременного перепрограммирования. Были выделены известные примеры генов. В скобках указано количество образцов в каждой группе.  (D) Уровни экспрессии генов коллагена, которые были восстановлены до юношеского уровня после кратковременного перепрограммирования. Образцы, кратковременно перепрограммированные в течение 13, 15 и 17 дней, объединяли. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Количество образцов в каждой группе указано в квадратных скобках. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни.    (E) Коробчатые диаграммы уровней белка коллагена I и IV в отдельных клетках после временного репрограммирования в течение 10 или 13 дней, рассчитанные на основе интенсивности флуоресценции в сегментированных клетках после иммунофлуоресцентного окрашивания. Прямоугольники представляют верхний и нижний квартили, а центральные линии - медиана. Уровни белка коллагена I и IV увеличиваются после временного перепрограммирования. Количество образцов в каждой группе указано в квадратных скобках. Репрезентативные изображения включены (нижняя панель). CD44 окрашен в зеленый цвет, коллаген I и IV - в красный, а окрашивание DAPI - в синий. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Затем мы посмотрели на весь транскриптом и наложили изменение экспрессии при старении на изменение экспрессии после кратковременного перепрограммирования. Как и ожидалось, мы наблюдали общую реверсию тенденции старения: гены, активируемые во время старения, подавлялись после кратковременного перепрограммирования, а гены, подавляемые во время старения, усиливались после кратковременного перепрограммирования (Рисунок 3C, дополнительный рисунок 2B). Примечательно, что структурные белки, подавляемые с возрастом, которые усиливаются при кратковременном перепрограммировании, включают цитокератины 8 и 18, а также субъединицы коллагена IV.

Производство коллагенов является основной функцией фибробластов (Humphrey et al., 2014), поэтому мы исследовали экспрессию всех генов коллагена во время старения фибробластов и во время кратковременного перепрограммирования (Рисунок 3D). Как было показано ранее (Lago and Puzzi, 2019; Varani et al., 2006), мы обнаружили, что коллаген I и IV снижается с возрастом, причем коллаген IV демонстрирует более резкое снижение. Примечательно, что экспрессия обоих генов восстановилась до юношеского уровня после кратковременного перепрограммирования (Рисунок 3D). Затем мы оценили с помощью иммунофлуоресценции, приводит ли эта повышенная экспрессия мРНК к увеличению уровней белка, и действительно обнаружили, что кратковременное перепрограммирование привело к увеличению белка коллагена I и IV в сторону более молодых уровней (рис. 3E). Наши данные показывают, что кратковременное перепрограммирование с последующей реверсией может омолаживать фибробласты как транскрипционно, так и на уровне белка, по крайней мере, на основе продукции коллагена. Это указывает на то, что наш протокол омоложения, в принципе, может восстановить молодую функциональность человеческих клеток.

Оптимальное кратковременное перепрограммирование может обратить вспять возрастные изменения в эпигеноме

Обнаружив доказательства транскриптомного омоложения, мы попытались определить, присутствуют ли также аспекты омоложения в эпигеноме. Первоначально мы исследовали глобальные уровни H3K9me3 с помощью иммунофлуоресценции. H3K9me3 представляет собой модификацию гистона, связанную с гетерохроматином, которая, как ранее было показано, уменьшается в глобальном масштабе с возрастом у ряда организмов (Ni et al., 2012), включая фибробласты человека (O'Sullivan et al., 2010; Scaffidi and Misteli , 2006). Мы смогли подтвердить это наблюдение и обнаружили, что MPTR смог существенно обратить вспять это возрастное сокращение до уровня, сопоставимого с фибробластами от более молодых доноров (средний возраст 33 года). Как 10, так и 13 дней кратковременного перепрограммирования увеличивают глобальные уровни H3K9me3, указывая на то, что эта эпигенетическая метка, подобная транскриптому, имеет относительно широкое окно для омоложения с помощью кратковременного перепрограммирования. Мы также наблюдали небольшое увеличение уровней H3K9me3 в клетках, которые не смогли перепрограммировать, что предполагает, что экспрессия только факторов перепрограммирования способна частично восстанавливать эту эпигенетическую метку (рис. 4A), как это наблюдалось для нашего предиктора возраста на основе транскриптома ( Рисунок 3А). Величина омоложения уровней H3K9me3 в наших кратковременно перепрограммированных клетках сходна с наблюдаемой при перепрограммировании фазы инициации (Sarkar et al., 2020).

Рис. 4. Оптимальное временное репрограммирование может обратить вспять возрастные изменения в эпигеноме.   (A) Коробчатые диаграммы уровней H3K9me3 в отдельных клетках, рассчитанные на основе интенсивности флуоресценции в ядрах (сегментированные с использованием DAPI). Было обнаружено, что уровни H3K9me3 снижаются с возрастом и повышаются после кратковременного перепрограммирования в течение 10 или 13 дней. Прямоугольники представляют верхний и нижний квартили, а центральные линии - медиана. Количество образцов в каждой группе указано в квадратных скобках. Репрезентативные изображения включены (правая панель). H3K9me3 окрашен в зеленый цвет, а окрашивание DAPI - в оттенки серого. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни.   (B) Средний возраст метилирования ДНК образцов после кратковременного перепрограммирования, рассчитанный с использованием мульти-тканевых часов (Horvath, 2013). Возраст метилирования ДНК существенно снижается после 13 дней перепрограммирования. Более короткие и более длительные периоды перепрограммирования приводят к меньшему сокращению возраста метилирования ДНК. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение. Выбросы в группе кратковременного перепрограммирования 13 дней были исключены из расчета среднего и стандартного отклонения. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни с (в скобках) и без выброса. Количество образцов в каждой группе указано в скобках под столбиками.   (C) Средняя длина теломер в образцах после кратковременного перепрограммирования, рассчитанная с помощью часов длины теломер (Lu et al., 2019). Длина теломер либо не изменилась, либо несколько уменьшилась после кратковременного перепрограммирования. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни.   (D) Средние уровни метилирования ДНК в омоложенной возрастной гипометилированной области. Эта область находится внутри промотора IRX5. Образцы, кратковременно перепрограммированные в течение 10, 13, 15 и 17 дней, объединяли для визуализации. В скобках указано количество образцов в каждой группе.   (E) Средние уровни метилирования ДНК в омоложенных возрастных гиперметилированных областях. Эти области находятся внутри промотора GAD1 и локуса HOXB. Образцы, кратковременно перепрограммированные в течение 10, 13, 15 и 17 дней, объединяли для визуализации. В скобках указано количество образцов в каждой группе.(E) Средние уровни метилирования ДНК в омоложенных возрастных гиперметилированных областях. Эти области находятся внутри промотора GAD1 и локуса HOXB. Образцы, кратковременно перепрограммированные в течение 10, 13, 15 и 17 дней, объединяли для визуализации. В скобках указано количество образцов в каждой группе.

Затем мы применили к нашим данным эпигенетические часы, мультитканевый предсказатель возраста, который предсказывает возраст на основе уровней метилирования ДНК в 353 сайтах CpG (Horvath, 2013). Примечательно, что за 13 дней кратковременного перепрограммирования мы наблюдали существенное снижение среднего возраста метилирования ДНК - примерно на 30 лет, количественно такое же омоложение, как мы видели в транскриптоме (Рисунок 4B). Более короткий период перепрограммирования (10 дней) привел к меньшему снижению возраста метилирования ДНК, что согласуется с нашими результатами профилирования возраста метилирования ДНК на протяжении всего процесса перепрограммирования, где возраст метилирования ДНК постепенно снижается на протяжении фазы созревания (Рисунок 1A). Удивительно, но мы также наблюдали меньшее снижение возраста метилирования ДНК при более длительном переходном времени перепрограммирования, предполагая, что некоторые аспекты наблюдаемого эпигенетического омоложения теряются во время фазы реверсии нашего протокола MPTR. Потенциально, длительное перепрограммирование (в течение 15 или 17 дней) может затруднить реверсию и привести к клеточным стрессам, которые "повторно состаривают" метилом во время процесса. Сходные результаты были получены с использованием другого предиктора возраста метилирования, кожных и кровяных часов (Horvath et al., 2018) (дополнительный рисунок 3A).

Теломеры - это защитные структуры на концах хромосом, состоящие из повторяющихся последовательностей. Длина теломер уменьшается с возрастом из-за репликации клеток в отсутствие ферментов теломеразы и восстанавливается после полного перепрограммирования в iPSC (Lapasset et al., 2011). Чтобы исследовать влияние кратковременного перепрограммирования на длину теломер, мы использовали часы длины теломер, которые предсказывают длину теломер на основании уровней метилирования в 140 сайтах CpG (Lu et al., 2019). Мы обнаружили, что MPTR не влияет на длину теломер, а в некоторых случаях немного уменьшает ее (Рисунок 4C). Это согласуется с нашими результатами профилирования длины теломер на протяжении всего перепрограммирования с использованием нашей системы, индуцируемой доксициклином, где длина теломер не увеличивалась до фазы стабилизации (дополнительный рисунок 3B).

Затем мы исследовали расположение обновленных сайтов CpG и обнаружили, что большинство из них были отдельными сайтами, разбросанными по геному (дополнительный рисунок 3C). Некоторые из этих отдельных сайтов CpG могут быть частью более крупных регионов омоложенного метилирования, которые мы не можем полностью обнаружить из-за целенаправленного характера профилирования массива метилирования ДНК, однако было обнаружено несколько небольших кластеров омоложенных сайтов CpG. Мы обнаружили, что небольшая область в промоторе IRX5 становится деметилированной с возрастом, и кратковременное перепрограммирование способно частично реметилировать эту область (рис. 4D). IRX5 участвует в эмбриональном развитии, поэтому деметилирование его промотора с возрастом может приводить к несоответствующей экспрессии (Cheng et al., 2005; Costantini et al., 2005). Мы также обнаружили две области, которые становятся гиперметилированными с возрастом и деметилируются в результате кратковременного перепрограммирования (рис. 4E). Одна из этих областей находится в промоторе GAD1; кодирует фермент, который катализирует превращение гамма-аминомасляной кислоты в глутаминовую кислоту (Bu et al., 1992). Другая область находится в локусе HOXB, участвует в формировании передне-заднего паттерна во время развития (Pearson et al., 2005). В целом, наши данные демонстрируют, что кратковременное перепрограммирование в течение 13 дней (но, по-видимому, не на более длительные или короткие периоды) представляет собой «золотую середину», которая способствует частичному омоложению метилома, уменьшая эпигенетический возраст примерно на 30 лет.

Обсуждение

Здесь мы разработали новый метод, кратковременное перепрограммирование в фазу созревания (MPTR), при котором факторы Яманака эктопически экспрессируются до тех пор, пока не будет достигнута фаза созревания перепрограммирования, а затем их индукция прекращается. MPTR значительно омолаживает все измеренные молекулярные признаки старения, включая транскриптом, эпигеном и функциональную экспрессию белка. Предыдущие попытки кратковременного перепрограммирования были ограничены фазой инициации, чтобы сохранить исходную идентичность клеток (Lu et al., 2020; Ocampo et al., 2016; Sarkar et al., 2020). Это серьезное беспокойство, так как полностью перепрограммированные iPSC может быть трудно дифференцировать в зрелые взрослые клетки, и вместо этого эти дифференцированные клетки часто напоминают свои фетальные аналоги (Hrvatin et al., 2014). С нашим подходом, клетки временно теряют свою клеточную идентичность, когда они вступают в фазу созревания, но, что важно, повторно приобретают свою первоначальную соматическую судьбу, когда факторы перепрограммирования удаляются. Это может быть результатом стойкой эпигенетической памяти в энхансерах (Jadhav et al., 2019), которая, как мы обнаружили, не стирается до фазы стабилизации. С помощью нашего метода, использующего более длительные периоды перепрограммирования, мы наблюдали устойчивое и существенное омоложение всего транскриптома, а также некоторых аспектов эпигенома, при этом многие функции стали примерно на 30 лет моложе. Эта степень омоложения существенно больше, чем то, что наблюдалось ранее для подходов перепрограммирования в фазе инициации. Метилом, по-видимому, требует более длительного перепрограммирования для существенного омоложения, и, следовательно, предыдущая работа с использованием более коротких отрезков перепрограммирования привела к умеренному омоложению метилома (Lu et al., 2020; Sarkar et al., 2020).

Что интересно,  мы также наблюдали транскриптомное омоложение генов с нефибробластными функциями. В частности, возрастная понижающая регуляция APBA2 и возрастная повышенная регуляция MAF были обращены (рис. 3C). APBA2 стабилизирует белок-предшественник амилоида, который играет ключевую роль в развитии болезни Альцгеймера (Araki et al., 2003). MAF регулирует развитие эмбриональных клеток волокон хрусталика, а дефекты этого гена приводят к развитию катаракты, которые являются частым осложнением в пожилом возрасте (Ring et al., 2000). Эти наблюдения могут сигнализировать о потенциале MPTR способствовать более общим сигнатурам омоложения, которые могут иметь значение для других типов клеток, таких как нейроны. Было бы интересно определить, возможно ли омоложение, вызванное MPTR, в других типах клеток, что может помочь нам понять и потенциально лечить возрастные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и катаракта.

В целом, наши результаты демонстрируют, что существенное омоложение возможно без достижения стабильной плюрипотентности, и предлагают захватывающую концепцию, согласно которой программа омоложения может быть отделена от программы плюрипотентности. Необходимы дальнейшие исследования для определения степени, в которой эти две программы могут быть разделены и могут привести к открытию новых мишеней, которые способствуют омоложению без необходимости перепрограммирования в ИПСК.

Методы

Производство плазмидов и лентивирусов

Полицистронный репрограммирующий вектор, индуцируемый доксициклином, был создан путем клонирования последовательности GFP-IRES ниже ответного элемента тетрациклина в основной цепи FUW-tetO-hOKMS (Addgene 51543). Этот вектор использовали в сочетании с FUW-M2rtTA (Addgene 20342). Вирусные частицы получали путем трансфекции клеток HEK293T упаковывающими плазмидами pMD2.G (Addgene 12259) и psPAX2 (Addgene 12260) и либо FUW-tetO-GFP-hOKMS, либо FUW-M2rtTA.

Перепрограммирование в ИПСК

Кожные фибробласты доноров среднего возраста (38-53 года) были приобретены у Lonza. Для лентивирусного перепрограммирования в ИПСК фибробласты размножались в среде фибробластов (DMEM-F12, 10% FBS, 1X глутамакс, 1X MEM-NEAA, 1X бета-меркаптоэтанол, 0,2X пенициллин / стрептомицин, 16 нг / мл FGF2) перед спинфекцией tetO -GFP-hOKMS и лентивирусы M2rtTA, где к клеткам добавляли 10% вирусного супернатанта и 8 мкг / мл полибрена перед центрифугированием при 1000 об / мин в течение 60 минут при 32 ° C. Перепрограммирование было инициировано через 24 часа после трансдукции лентивирусом путем введения в среду доксициклина (2 мкг / мл). Впоследствии среду меняли ежедневно на протяжении всего эксперимента. На 2 день перепрограммирования клетки отсортировывали в потоке на наличие жизнеспособных GFP-положительных клеток и затем культивировали на планшетах, покрытых желатином. На 7 день перепрограммирования клетки повторно высевали на облученные эмбриональные фибробласты мыши (iMEF), а на 8 день перепрограммирования среду заменяли на среду hES (DMEM-F12, 20% KSR, 1X Glutamax, 1X MEM-NEAA, 1X beta -меркаптоэтанол, 0,2Х пенициллин / стрептомицин, 8 нг / мл FGF2). Для кратковременного перепрограммирования клетки сортировали в потоке на 10, 13, 15 или 17 день перепрограммирования на популяции CD13 + SSEA4- и CD13-SSEA4 +. Затем эти клетки повторно высевали на iMEF в среде фибробластов без доксициклина и впоследствии поддерживали как фибробласты без iMEF. Для полного перепрограммирования колонии отбирали на 30 день и переносили на покрытые витронектином планшеты в среде E8 без доксициклина. Колонии поддерживали, как описано ранее (Milagre et al., 2017), и собирали на 51 день перепрограммирования.

Для перепрограммирования в iPSC при помощи вируса Sendai с использованием набора CytoTune ™ -iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen) фибробласты перепрограммировали, как описано ранее (Milagre et al., 2017).

Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) промежуточных продуктов перепрограммирования

Клетки предварительно обрабатывали 10 мкМ Y-27632 (технологии STEMCELL) в течение 1 часа. Клетки собирали с использованием реагента для диссоциации клеток StemPro ™ Accutase ™ и инкубировали с антителами против CD13 (PE, 301704, Biolegend), SSEA4 (AF647, 330408, Biolegend) и CD90.2 (APC-Cy7, 105328, Biolegend) в течение 30 минут. Клетки дважды промывали 2% FBS в PBS и пропускали через фильтр 50 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Непосредственно перед сортировкой клетки окрашивали DAPI с концентрацией 1 мкг / мл. Одноцветные контроли использовались для выполнения компенсации, и ворота были установлены на основе образцов «промежуточного отрицательного контроля». Клетки сортировали с помощью проточного цитометра BD FACSAria ™ Fusion (BD Biosciences) и собирали либо для дальнейшего культивирования, либо для экстракции ДНК / РНК.

Массив метилирования ДНК

Геномную ДНК экстрагировали из образцов клеток с помощью набора для крови и тканей DNeasy (Qiagen), следуя инструкциям производителя и включая необязательный этап расщепления РНКазой. Для промежуточных стадий репрограммирования геномная ДНК экстрагировалась вместе с РНК с помощью мини-набора AllPrep DNA / RNA (Qiagen). Образцы геномной ДНК были дополнительно обработаны в Barts и Лондонском центре генома и обработаны на массивах Infinium MethylationEPIC (Illumina).

РНК-Seq

РНК экстрагировали из образцов клеток с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen), следуя инструкциям производителя. Для промежуточных стадий репрограммирования и репрограммированных образцов вируса Sendai РНК экстрагировали вместе с геномной ДНК с помощью мини-набора AllPrep DNA / RNA (Qiagen). Образцы РНК обрабатывали ДНКазой (Thermo Scientific) для удаления загрязняющей ДНК. Библиотеки РНК-Seq были приготовлены в Wellcome Sanger Institute и запущены в системе HiSeq 2500 (Illumina) для одностороннего секвенирования 50 п.н. Для перепрограммированных образцов вируса Sendai библиотеки готовили, как описано ранее (Milagre et al., 2017), и запускали на HiSeq 2500 (Illumina) для секвенирования парных концов 75 п.н.

Анализ метилирования ДНК

Данные массива были обработаны с помощью пакета minfi R и нормализации NOOB для генерации бета-значений. Возраст метилирования ДНК рассчитывали с использованием мультиканевых часов (Horvath, 2013) и часов кожи и крови (Horvath et al., 2018). Длину теломер рассчитывали с помощью часов длины теломер (Lu et al., 2019). Справочные наборы данных для перепрограммирования фибробластов и ИПСК были получены от Ohnuki et al (2014) (GEO: GSE54848), Banovich et al (2018) (GEO: GSE110544) и Horvath et al (2018). Кроме того, контрольные наборы данных включали новые данные, исследующие промежуточные стадии перепрограммирования дермальных фибробластов с помощью набора CytoTune ™ -iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen).

РНК-Seq анализ

Считывания были обрезаны с помощью Trim Galore (версия 0.6.2) и сопоставлены с геномом человека (GRCh38) с помощью Hisat2 (версия 2.1.0). Необработанные подсчеты и log2 преобразованные  подсчеты были созданы с помощью Seqmonk (версия 1.45.4). Справочные наборы данных для фибробластов и ИПСК были получены от Fleischer et al (2018) (GEO: GSE113957) и Banovich et al (2018) (GEO: GSE107654). Кроме того, контрольные наборы данных включали новые данные, исследующие промежуточные стадии перепрограммирования дермальных фибробластов с помощью набора CytoTune ™ -iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen). Образцы переносились для дальнейшего анализа, если у них было общее количество считываний не менее 500000, при этом не менее 70% считываний отображались на гены и не менее 65% считываний отображались на экзоны.

Иммунофлуоресценция и визуализация

Молодые контрольные дермальные фибробласты были приобретены у Lonza и Coriell Institute (GM04505, GM04506, GM07525, GM07545 и AG09309). Окрашивание антител выполняли, как описано ранее (Santos et al., 2003), на клетках, выращенных на покровных стеклах или цитоспанте на покровном стекле после фиксации 2% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре. Вкратце, клетки пермеабилизировали 0,5% TritonX-100 в PBS в течение 1 часа; блокировали 1% BSA в 0,05% Tween20 в PBS (BS) в течение 1 часа; инкубировали в течение ночи при 4 ° C с соответствующим первичным антителом, разведенным в BS; с последующей промывкой BS и вторичным антителом. Все вторичные антитела были конъюгированы с Alexa Fluor (Molecular Probes), разведены 1: 1000 в BS и инкубированы в течение 30 минут. Инкубации проводили при комнатной температуре, если не указано иное. ДНК контрастировали с 5 мкг / мл DAPI в PBS. Оптические срезы были получены с помощью микроскопа Zeiss LSM780 (иммерсионный объектив 63x). Полуколичественный анализ флуоресценции выполняли с помощью Volocity 6.3 (Improvision). Для полуколичественного определения коллагена I и IV использовали 3D-рендеринг z-стеков. Одиночные средние оптические срезы использовались для полуколичественного определения H3K9me3. Используемые антитела и разведения перечислены ниже:

Anti-H3K9me3; 07-442, Merck/ Millipore (1:500)

Anti-Collagen I; ab254113, Abcam (1:400)

Anti-Collagen IV; PA5-104508, Invitrogen (1:200)

Anti-CD44-BB515; 564587, BD Biosciences (1:400)

Анализ данных

Последующий анализ данных РНК-seq и метилирования ДНК был выполнен с использованием R (версия 4.0.2). Ggplot2 (версия 3.3.2) использовался для создания гистограмм, коробчатых диаграмм, линейных диаграмм, круговых диаграмм, диаграмм рассеяния и скрипичных диаграмм. Ggalluvial (версия 0.12.2) использовался для создания аллювиальных графиков. ComplexHeatmap (версия 2.4.3) использовался для создания тепловых карт. Боевая функция из пакета sva (версия 3.36.0) использовалась на рисунке 1F для пакетной коррекции нового набора данных перепрограммирования Sendai  для других наборов данных. Боевая функция также использовалась на рисунке 3 для пакетной корректировки эталонного набора данных о старении фибробластов (Fleischer et al., 2018) в наш набор данных. Часы транскрипции были обучены на эталонном наборе данных о старении с пакетной коррекцией с использованием пакета Caret R (Kuhn, 2008) и случайной лесной регрессии с 10-кратной перекрестной проверкой. Обновленные сайты CpG были обнаружены путем сравнения разницы в метилировании из-за возраста (рассчитанной с помощью набора данных Horvath et al, 2018) с разницей в метилировании из-за 13 дней кратковременного перепрограммирования. Сайты CpG были классифицированы как обновленные, если они демонстрировали разницу в метилировании 10% за 40 лет старения, которая была обращена кратковременным перепрограммированием.

Вклад авторов

D.G.задумал проект, разработал и выполнил эксперименты по временному перепрограммированию, провел анализ данных и написал рукопись. A.P.помог разработать эксперименты по временному перепрограммированию и написать рукопись. F.S. провели иммунофлуоресцентные эксперименты. I.H. предоставил биоинформатическую поддержку анализу метилирования. T.M.S. предоставил полезные обсуждения для разработки проекта и помог с дизайном экспериментов по кратковременному перепрограммированию. I.M. провел полезные обсуждения для разработки проекта, разработал и провел эксперименты по перепрограммированию Sendai и помог написать рукопись. W.R. провел полезные обсуждения проекта и интерпретации данных, а также помог написать рукопись.

 Дополнительные изображения

Дополнительный рисунок 1.   (A) Средний возраст метилирования ДНК (рассчитанный с использованием часов кожи и крови (Horvath et al., 2018)) на протяжении всего процесса репрограммирования, когда клетки трансдуцировались нашим вектором tetO-GFP-hOKMS и непрерывно обрабатывались 2 мкг / мл доксициклина. . Перепрограммирование делится на три отдельные фазы: фаза инициации (IP); фаза созревания (MP) и фаза стабилизации (SP). Возраст метилирования ДНК существенно снизился во время фазы созревания репрограммирования в клетках, которые были успешно перепрограммированы (пурпурная линия), но не в контрольных клетках (желтые и оранжевые линии представляют нетрансдуцированные клетки и клетки, экспрессирующие hOKMS, но неспособные перепрограммироваться, как указано маркерами клеточной поверхности. , соответственно). Точки представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. N = 3 биологических повтора для каждого состояния, когда фибробласты были получены от разных доноров. N = 2 биологических повтора для временной точки ИПСК (день 51).   (B) Процент клеток, измеренный в каждом квадранте во время сортировки потока для успешного перепрограммирования ячеек (верхняя панель). Клетки были классифицированы как только CD13 (CD13 + SSEA4-), дважды отрицательные («DN», CD13-SSEA4-), дважды положительные («DP», CD13 + SSEA4 +) или только SSEA4 (CD13-SSEA4 +). Собранные клетки имеют цветовую маркировку (светло-желтый = промежуточный продукт отрицательного контроля, светло-оранжевый = не удалось временно перепрограммировать промежуточный продукт, светло-пурпурный = промежуточный промежуточный продукт репрограммирования). Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Типичные графики проточной цитометрии (нижняя панель) показывают, где были размещены ворота для определения наличия / отсутствия поверхностных маркеров.

Дополнительный рисунок 2.   (A) Средний возраст транскрипции, рассчитанный с использованием пользовательских часов транскриптома (ошибка = 13,5 лет) для кратковременно перепрограммированных фибробластов в фазе инициации (Sarkar et al., 2020). В скобках указано количество образцов в каждой группе. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение.   (B) Уровни экспрессии известных генов, которые были восстановлены до юношеских уровней после кратковременного перепрограммирования. Образцы, перепрограммированные в течение 13, 15 и 17 дней, объединяли. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. Количество образцов в каждой группе указано в квадратных скобках.

Дополнительный рисунок 3.(A) Средний возраст метилирования ДНК образцов после кратковременного перепрограммирования, рассчитанный с использованием часов кожи и крови (Horvath et al., 2018). Возраст метилирования ДНК существенно снижается после 13 дней перепрограммирования. Более короткие и более длительные периоды перепрограммирования приводят к меньшему сокращению возраста метилирования ДНК. Столбцы представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение. Значимость рассчитывалась с помощью U-критерия Манна-Уитни. В скобках указано количество образцов в каждой группе.   (B) Средняя длина теломер (рассчитанная с использованием часов длины теломер (Lu et al., 2019)) на протяжении всего процесса перепрограммирования, когда клетки трансдуцировались нашим вектором tetO-GFP-hOKMS и непрерывно обрабатывались 2 мкг / мл доксициклина. Перепрограммирование делится на три отдельные фазы: фаза инициации (IP); фаза созревания (MP) и фаза стабилизации (SP). Длина теломер уменьшается во время фаз инициации и созревания и начинает увеличиваться во время фазы стабилизации. Точки представляют собой среднее значение, а столбцы ошибок - стандартное отклонение. N = 3 биологических повтора для каждого состояния, когда фибробласты были получены от разных доноров. N = 2 биологических повтора для временной точки ИПСК (день 51).   (C) Расположение омоложенных сайтов CpG после 13 дней перепрограммирования. Сайты, омоложенные деметилированием, окрашены в синий цвет, а сайты, омоложенные метилированием, окрашены в розовый цвет.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Рейка за полезные обсуждения. Мы хотели бы поблагодарить центр биоинформатики в Институте Бабраама за обработку данных секвенирования и центр проточной цитометрии в Институте Бабраама за сортировку клеток. Мы также хотели бы поблагодарить службы секвенирования в Институте Сэнгера и Барта и Лондонском центре генома за услуги по секвенированию и метилированию соответственно. Эта работа финансировалась BBSRC. A.P. поддерживается стипендией сэра Генри Веллкома (215912 / Z / 19 / Z). W.R. - консультант и акционер Cambridge Epigenetix. T.S.является генеральным директором и акционером Chronomics.

Опубликовано: 17 января 2021 г.

Авторы: Diljeet Gill, Aled Parry, Fátima Santos, Irene Hernando-Herraez, Thomas M. Stubbs, Inês Milagre, Wolf Reik

Оригинальная статья: Multi-omic rejuvenation of human cells by maturation phase transient reprogramming

Перевод Ник Сестрин