Впервые в истории медицины донорские индуцированные стволовые клетки были превращены в клетки сетчатки и пересажены пациенту.

Житель Японии стал первым человеком, получившим инъекцию донорских индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Хирурги ожидают, что в будущем область применения таких клеток расширится. По адаптивности донорские стволовые клетки сравнимы с эмбриональными, но их применение не вызывает этических разногласий. Появление клеточных банков могло бы сделать процедуру трансплантации стволовых клеток более удобной и одновременно снизить её цену. Кроме того, в пересадке обычно нуждаются люди пожилого возраста, а с годами в клетках накапливаются генетические аномалии, что повышает риск осложнений после трансплантации. Использование клеток молодых доноров могло бы решить также и эту проблему.

Донорские индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — это клетки, полученные у взрослого человека (например, из кожи), а затем «перепрограммированные» для возврата в эмбриональное состояние. Впоследствии такие «зародышевые» клетки могут быть превращены в клетки определённого типа, необходимые для лечения того или иного заболевания.

В ходе подготовки к процедуре, которую в возрасте 60 с лишним лет перенёс житель японской префектуры Хёго (яп. 兵庫県), клетки кожи анонимного донора были превращены в клетки сетчатки. Затем врачи пересадили полученные клетки на сетчатку пациента — он страдал возрастной дистрофией жёлтого пятна. Специалисты надеются, что процедура поможет остановить прогрессирование заболевания, способного привести к слепоте.

В сентябре 2014 г. в Медицинском центре больницы общей практики г. Кобе (яп. 神戸市立医療センター中央市民病院, англ. Kobe City Medical Center General Hospital) жительница Японии уже перенесла сходную процедуру. Но тогда клетки были получены из её собственной кожи. Планировалось также провести пересадку этих клеток другому пациенту, но в них были обнаружены генетические аномалии, и от процедуры отказались. В феврале 2017 г. исследователи сообщили, что пациентка хорошо себя чувствует. Пересаженные клетки выжили, а дальнейшего ухудшения зрения, характерного для дистрофии жёлтого пятна, не произошло.

В новое исследование, в ходе которого была произведена пересадка донорских клеток пожилому мужчине, планируется включить 5 пациентов. Так как донорские клетки не идентичны клеткам пациентов, нуждающихся в них, существует определённый риск отторжения. Но Синъя Яманака (яп. 山中 伸弥, англ. Shinya Yamanaka), учёный, в 2012 г. получивший Нобелевскую премию за открытие индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, борется за то, чтобы сохраняемые в банках клетки подходили реципиентам в достаточной степени. В настоящее время Яманака занимается запуском банка стволовых клеток, в котором подходящий донор будет выбираться путём сопоставления трёх генов главного комплекса гистосовместимости человека. Последний представляет собой комплекс белков на поверхности клеток, инициирующий иммунный ответ. На сегодняшний день в Банке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток регенеративной медицины (iPS Cell Stock for Regenerative Medicine) хранятся клеточные линии, полученные у одного донора. Но сотрудники банка надеются, что к марту 2018 г. им удастся создать 5—10 типированных по гистосовместимости клеточных линий. Это количество линий должно оказаться достаточным для того, чтобы охватить 30—50% населения Японии.

29.03.2017 Источник: 22century.ru

По словам премьера, цель правительства в том, чтобы "снизить риски возникновения таких нарушений, усилить ответственность всех, кто в этом процессе участвует"

Премьер-министр РФ Дмитрий Медведев подписал антидопинговое постановление, утверждающее перечень субстанций и методов, которые запрещены в российском спорте. Об этом он заявил на заседании правительства.

«Я подписал постановление, которое утверждает перечень субстанций и методов, которые запрещены для использования в спорте. Речь идет о допинге и недобросовестной конкуренции, о ситуациях, когда спортсмена склоняют к использованию запрещенных веществ, манипулируют анализами крови, проводят нелегальные химические действия, генный допинг», – сказал Медведев.

По словам премьера, цель правительства заключается в том, чтобы «снизить риски возникновения таких нарушений, усилить ответственность всех, кто в этом процессе участвует», «А это и тренеры, и врачи, и специалисты, которые участвуют в подготовке атлетов», – уточнил Медведев. Он напомнил, что в прошлом году были внесены изменения в Уголовный кодекс, введена уголовная ответственность за склонение спортсменов к использованию допинга и другим противоправным действиям в этой сфере. «Сейчас мы утверждаем конкретный перечень этих веществ и манипуляций», – резюмировал Медведев.

Содержание документа

Как сообщается на сайте кабмина, в перечень включены: запрещенные субстанции, в том числе анаболические агенты, пептидные гормоны, факторы роста и миметики, гормоны и модуляторы метаболизма, а также запрещенные методы, в том числе манипуляции с кровью и ее компонентами, химические и физические манипуляции и генный допинг.

В постановлении, опубликованном на сайте правительства, на нескольких страницах перечисляются запрещенные субстанции, а также описаны методы, в отношении которых введен запрет. В частности, пункт, касающийся генного допинга, гласит о запрете «использования нормальных или генетически модифицированных клеток», а также «переноса полимеров нуклеиновых кислот» или их аналогов.

Под запрещенными химическими и физическими манипуляциями в документе понимаются внутривенные инъекции в определенном объеме, за исключением случаев оказания необходимой медицинской помощи. Запрещаются также «все формы внутрисосудистых манипуляций с кровью или ее компонентами физическими или химическими методами», искусственное улучшение процессов переноса кислорода в крови, введение любого количество «аутологической, аллогенной (гомологической) или гетерологической крови или препаратов красных клеток крови любого происхождения в сердечно-сосудистую систему».

Закон против склонения к допингу

Закон, вводящий уголовную ответственность за склонение спортсменов к употреблению допинга, был принят в ноябре прошлого года. Согласно документу, склонение спортсмена тренером, врачом или другим специалистом к использованию запрещенных субстанций или методов будет наказываться штрафом в размере до 300 тыс. рублей с лишением права занимать определенные должности на срок до 3 лет.

Судья сможет также назначить наказание в виде ограничения свободы на срок до 1 года. Если преступление будет совершено группой лиц по предварительному сговору в отношении одного или нескольких несовершеннолетних спортсменов либо с применением насилия или с угрозой его применения, оно будет наказываться штрафом до 500 тыс. рублей либо лишением свободы на срок до 1 года. В качестве альтернативного наказания добавлена возможность ограничения свободы на срок до 2 лет с запретом работать на определенных должностях до 4 лет.

Тренеру, врачу или другому специалисту в области физкультуры и спорта, давшему спортсмену «независимо от его согласия» запрещенные субстанции, будет грозить штраф до 1 млн рублей, либо ограничение свободы на срок до 2 лет, либо лишение свободы на срок до 1 года с запретом работать на определенных должностях или заниматься определенной деятельностью на срок до 4 лет. Если же данные преступления повлекут по неосторожности смерть спортсмена или иные тяжкие последствия, виновному грозит ограничение свободы на срок до 3 лет, принудительные работы на срок до 3 лет или лишение свободы на срок до 3 лет. Также суд может на 5 лет запретить осужденному работать на определенных должностях или заниматься определенной деятельностью.

30.03.2017 Источник: tass.ru

Ученые из Бостонского университета впервые создали широкомасштабную систему генетических блоков, позволяющую программировать действия человеческих клеток с применением булевой алгебры. Статья опубликована в Nature Biotechnology.

Система, которую ученые назвали BLADE (Boolean logic and arithmetic through DNA excision), позволяет контролировать внутриклеточные процессы с помощью рекомбиназ. Рекомбиназы — это ферменты, которые умеют разрезать и сшивать нить ДНК и способны работать и как активаторы, и как репрессоры транскрипции. Активация может быть достигнута, например, при вырезании области терминатора транскрипции, расположенного перед интересующим геном (ИГ), или при разворачивании ИГ в правильную сторону относительно промотора. В свою очередь, репрессия может быть достигнута вырезанием самого ИГ или разворачиванием его в неправильную сторону. Вырезать по вышеописанной схеме умеют тирозин-зависимые рекомбиназы, а разворачивать — серин-зависимые. Для них в «текст» ДНК помещают специальные сайты — специфические последовательности из нескольких нуклеотидов по обе стороны от нужного участка, которые рекомбиназы узнают и приступают к работе. Ученые протестировали работу двенадцати рекомбиназ в почечных эмбриональных клетках человека и выбрали две наиболее подходящие — Cre и Flp, которые функционируют совершенно независимо друг от друга.

16 типов логических значений (булевых операторов), реализованных с помощью разного расположения сайтов двух рекомбиназ

Возможность по-разному располагать сайты этих двух рекомбиназ относительно последовательности ИГ и его терминатора позволила ученым разработать соответствующие схемы для всех шестнадцати существующих логических значений (булевых операторов), таких как «И» и «ИЛИ», и использовать их для создания логической системы с N вводами (в описанном выше случае N=2, по числу типов рекомбиназ) и M состояниями. В результате сочетания таких операторов в ДНК можно путем их «включения» и «выключения» добиться сложной регуляции работы генов в клетке. Кроме того, разнообразить работу рекомбиназ позволило использование дополнительных сайтов, слегка мутированных — рекомбиназа зачастую работает таким образом, что узнает только совершенно одинаковые сайты (они могут быть оба мутированными или оба нормальными, но не разными).

Для того, чтобы протестировать работу системы BLADE, исследователи, в том числе, работали с четырьмя генами, кодирующими флуоресцентные белки tagBFP, EGFP, iRFP720 и mRuby2 в клетках лимфоцитов Jurkat T, используя доксициклиновую регуляцию (что позволяло дозировать эффект работы рекомбиназ). Блоки, составленные из операторов, были устроены таким образом, чтобы включать отдельные гены в четырех разных состояниях: при попадании в ядро каждой из рекомбиназ по отдельности, при отсутствии их обеих или при наличии их обеих одновременно. Эксперимент подвердил, что рекомбиназы работают правильным образом, и соответствующие белки светились в клетках даже через две недели после начала эксперимента.

Работа четырех генов, кодирующих разные флуоресцентные белки, в 4 вариантах состояний системы (вверху - до добавления доксициклина, внизу - при достижении его максимальной концентрации)

После этого ученые составили библиотеку из 113 блоков, размерами превышающую все ранее описанные библиотеки подобного типа, и протестировали работу блоков с помощью векторного теста, измеряя угол отклонения реальных результатов работы каждого из блоков от правильного направления согласно «истинной таблице», составленной заранее. Отклонение в 0° подразумевало идеальную работу блока, а угол 90° означал полное несоответствие заданного и полученного направлений. Тест показал, что 106 из 113 блоков отклонялись от заданного направления не более, чем на 15 процентов. Ни один блок не отклонился от него более, чем на 25 процентов. Кроме того, более 96 процентов блоков были ближе всего именно к своему идеальному направлению — что является самым высоким результатом среди всех подобных проектов, проводящихся, главным образом, с кишечными палочками.

После этого были проведены дополнительные эксперименты, показавшие, что работу BLADE можно совмещать с работой CRISPR-Cas9 систем. BLADE не нарушает деятельности CRISPR-Cas9 и может работать с РНК-проводниками (gRNA), снабженными соответствующими сайтами. Кроме того, работу BLADE можно контролировать, например, с помощью лекарственных средств — таких, как 4-гидроксиамоксифен, который будет «отпускать» рекомбиназы, предварительно связанные с мутированным рецептором эстрогена, и позволять им попадать в ядра тогда, когда это бывает нужно.

Это первая система генетических блоков, которая работает со столь высокой эффективностью при таком количестве операторов и протестирована на человеческих, а не на бактериальных клетках. О менее масштабных экспериментах с кишечной палочкой мы уже рассказывали раньше. Ученые полагают, что такие системы можно будет применять для решения самых разнообразных биоинженерных и медицинских задач.

30.03.2017 Источник: Анна Казнадзей nplus1.ru

Сотрудники лаборатории Сергея Разина из Института биологии гена РАН в составе международной команды ученых модифицировали метод для определения трехмерной организации хромосом и применили его для изучения пространственной организации ДНК в зрелых яйцеклетках до и после оплодотворения. Статья опубликована в журнале Nature.

Высокий уровень сложности многоклеточных организмов определяется большим разнообразием типов клеток, выполняющих самые разные функции. Это разнообразие появляется в ходе дифференцировки клеток, которая происходит начиная с самых ранних стадий эмбрионального развития. Отправной точкой для развития и дифференцировки является зигота – клетка, которая образуется после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом. Несмотря на то, что половые клетки являются строго дифференцированными, зигота, образующаяся в результате их слияния, обладает свойством тотипотентности, т.е. способна дать начало любому типу клеток организма. В медицинской биотехнологии в настоящее время активно исследуется возможность обратить процессы клеточной дифференцировки и вернуть клеткам свойство тотипотентности, однако, несмотря на некоторые успехи, имеющихся знаний для этого пока недостаточно.

Известно, что в процессе «перезагрузки» клеток от дифференцированного состояния к базовому уровню происходит смена эпигенетического статуса ДНК. К эпигенетическим изменениям относятся не только химические модификации ДНК и связанных с ней белков, такие, как метилирование, но и изменение пространственной организации ДНК внутри ядра. Трехмерная структура генома во многом определяет работу отдельных генов, ведь у эукариот ген и его регуляторные элементы нередко находятся очень далеко друг от друга. Совсем недавно эту трехмерную структуру научились исследовать на уровне отдельных клеток, однако для половых клеток это было невозможно из-за крайне малого количества ДНК, доступного для анализа (напомним, что половые клетки обладают одиночным набором хромосом, т.е. в два раза меньшим количеством ДНК по сравнению с соматическими клетками). В своей работе российские ученые предложили модификацию основного на сегодняшний день метода для определения трехмерной структуры генома – Hi-C, что позволило работать не только с ДНК отдельных ооцитов, но и с ДНК отдельных ядер внутри зиготы сразу после оплодотворения.

Несмотря на то, что некоторые самые бросающиеся в глаза особенности организации хроматина (ДНК в комплексе с сопутствующими белками и РНК) можно различить в световой или электронный микроскоп, активное изучение трехмерной организации генома началось относительно недавно с изобретением в 2002 году метода 3С (Chromatin Conformation Capture, т.е. фиксация структуры хроматина). Суть его заключается в том, что клетки обрабатывают формальдегидом, который фиксирует комплексы ДНК с белком, затем ДНК в составе комплексов выделяют, при помощи ферментов разрезают на небольшие фрагменты и сшивают снова. В итоге у исследователя в руках оказывается библиотека гибридных фрагментов ДНК, в состав которых входят последовательности, которые в ядре были расположены рядом друг с другом. Дальше все зависит от методов анализа этой библиотеки – чем более производительные методы используются, тем больше информации можно получить. 

Исходно метод 3С предполагал, что можно проверить взаимодействие двух конкретных участков в геноме («один с одним»). Однако его изобретатели быстро начали увеличивать количество букв С, добавляя новые этапы, упрощающие анализ библиотеки, что привело к появлению технологий 4С («circularized 3C», изучение взаимодействий «один со всеми»), 5С («3C carbon copy», «многие со многими») и наконец Hi-C (от «high-throughput С», при помощи которого можно исследовать «все со всеми» взаимодействия). Технология Hi-C позволяет проанализировать библиотеку полностью благодаря появлению высокопроизводительного секвенирования ДНК, хотя базовый принцип остался тот же самый, что и в 3С. С использованием Hi-C удалось построить трехмерные карты хромосом человека, и определить, что «активный» хроматин, гены в составе которого активно экспрессируются, и «неактивный» формируют в ядре два отдельных компартмента (А-В компартменты). Очередной прорыв в области изучения трехмерной организации генома случился в 2013 году, когда с появлением технологии single-cell sequencing (секвенирование единичной клетки) стало возможным изучить 3D-структуру хромосом в отдельной клетке. Однако этого по-прежнему было недостаточно для исследования ооцитов.

Схема эксперимента Hi-C — от выделения отдельных ядер до секвенирования.

Стандартная методика Hi-C предполагает несколько этапов обогащения библиотеки с использованием модифицированных нуклеотидов, которые включаются в состав полученных фрагментов. В случае, когда исходного материала много, эти этапы помогают избавиться от ДНК, которая почему-то не прошла обработку на предшествующих стадиях. Однако если стартовое количество ДНК исчезающее мало, они приводят только к потере материала в ходе эксперимента. Авторы работы модифицировали протокол Hi-C, отбросив стадии, приводящие к потерям, и увеличили на порядок чувствительность метода, который они назвали single-nucleus Hi-C (Hi-C для единичного ядра). Для того чтобы оценить изменения, происходящие в структуре хроматина ооцитов, ученые сравнили ядра незрелых и зрелых ооцитов (яйцеклеток). Как и ожидалось, с созреванием ооцита хроматин становился более компактным и неактивным. 

Ключевой эксперимент работы был призван дать ответы на вопросы, что происходит с хроматином при «перезагрузке» клетки после оплодотворения, наследуется ли состояние хроматина или формируется заново, а также отличается ли состояние хроматина в материнском и отцовском ядрах в составе зиготы, образовавшейся после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом (на стадии зиготы ядра сосуществуют в клетке и не сливаются). 

Обнаружилось, что в составе как отцовского, так и материнского ядер можно выделить структуры первичных уровней организации – хроматиновые петли и так называемые топологически ассоциированные домены. Структуры более высокого порядка — А-В компартменты активного и неактивного хроматина в отцовском ядре детектировались слабо, однако, к удивлению исследователей, в материнском ядре они вообще не были заметны. Таким образом, авторы работы обнаружили, что зигота содержит ядро, находящееся в стадии интерфазы, т.е. неделящееся, но при этом без признаков компартментализации хроматина, что среди всех тканей и клеток млекопитающих является уникальным случаем. Исходя из этих данных, предполагается, что формирование компартментов в ядрах происходит по-разному – в материнском они формируются заново, а в отцовском наследуются, либо формируются раньше. Кроме того, на основании полученных структур и компьютерных симуляций можно предположить, что организация хроматина в материнском ядре ближе всего к организации метафазной хромосомы, т.е. материнское ядро зиготы ближе к соматической клетке, чем дифференцированный ооцит или сперматозоид. Наконец, эти данные свидетельствуют о том, что разные уровни организации хроматина (а именно петли и А-В компартменты) формируются по разным механизмам.

Хочется отметить, что подобного уровня работы стали осуществимы благодаря взрывному развитию технологий анализа ДНК и РНК буквально за последние несколько лет. Теперь авторы работы хотят дополнить свою работу анализом экспрессии генов и метилирования ДНК на уровне единичной клетки, а нам остается только удивляться и ждать, какие еще возможности сегодня-завтра подкинет ученым прогресс.

30.03.2017 Источник: Дарья Спасская nplus1.ru