Исследователи Национального института глаза США под руководством доктора Станислава Томарева (Stanislav Tomarev) установили, что выделения стволовых клеток, так называемые экзосомы, обладают способность защищать клетки сетчатки – светочувствительной ткани глаза – от повреждения.

 

 На полученном с помощью микроскопа изображении видны экзосомы (зеленого цвета),
окружающие ганглионарные клетки (оранжевого и желтого цветов).

 

Экзосомы представляют собой крошечные мембранные пузырьки, формирующиеся внутри клеток и впоследствии выходящие за их пределы. На протяжении длительного времени было принято считать, что экзосомы являются компонентом экскреторной системы клетки, однако недавно ученые установили, что эти пузырьки наполнены белками, жирами и РНК, регулирующими активность генов. Эксперименты показали, что экзосомы одной клетки могут поглощаться другой клеткой путем слияния с мембраной клетки-мишени, что запускает в ней синтез новых белков. Экзосомы также облегчают межклеточные взаимодействия и играют роль сигнальных элементов, что свидетельствует об их потенциальном терапевтическом потенциале.

В рамках своего исследования доктор Бен Мид (Ben Mead) изучил влияние высвобождаемых стволовыми клетками экзосом на ганглионарные клетки сетчатки, формирующие зрительный нерв, обеспечивающий передачу визуальных сигналов от глаза в головной мозг. Гибель этих клеток при глаукоме и других оптических нейропатиях приводит к утрате зрения.

Стволовые клетки привлекают внимание ученых, пытающих заместить или восстановить поврежденные ткани, из-за их способности дифференцироваться в любые типы клеток организма. Однако с практической точки зрения использование выделенных из стволовых клеток экзосом обладает целым рядом преимуществ перед трансплантацией самих стволовых клеток. По словам Мида, экзосомы можно очистить, поместить на хранение и использовать в строго дозированных количествах, что невозможно при работе со стволовыми клетками.

Еще одним важным преимуществом экзосом является отсутствие риска, ассоциированного с трансплантацией живых стволовых клеток в ткани глаза, что потенциально может вызывать развитие осложнений, таких как иммунное отторжение и нежелательный рост клеток.

Авторы изучили влияние экзосом, выделенных из стволовых клеток костного мозга, на ганглионарные клетки сетчатки крысиной модели глаукомы.

В начале эксперимента животным повреждали оптический нерв одного глаза, после вводили в стекловидное тело поврежденного глаза экзосомы в дозе 3Х10⁹. Инъекции повторяли спустя 7 и 14 дней. До введения экзосомы метили флуоресцентными метками, что позволило оценивать доставку их содержимого внутрь ганглионарных клеток сетчатки. На 21-й день эксперимента крыс умерщвляли, после чего анализировали состояние их сетчатки.

Согласно полученным данным, введение экзосом обеспечивало сохранение около 70% ганглионарных клеток сетчатки, тогда как в группе контроля, не получавшей терапевтических инъекций, погибало до 90% этих клеток. Помимо этого, по данным электроретинографии, оценивающей электрическую активность клеток сетчатки, введение экзосом обеспечивала сохранение функциональности ганглионарных клеток.

Авторы установили, что защитное влияние экзосом опосредовано молекулами микроРНК, изменяющими или подавляющими экспрессию генов. По словам доктора Томарева, для получения более подробной информации о содержимом экзосом необходимо проведение дальнейших исследований. Необходимо установить, какая именно микроРНК из более чем 2 000 известных молекул доставляется в ганглионарные клетки и на какие белки или сигнальные пути они воздействуют внутри клеток. Помимо этого исследователи планируют заняться создания экзосом, специфичных для определенных типов нейронов и других клеток или групп клеток.

Помимо этого они отмечают необходимость идентификации оптимального подхода к применению экзосом, в том числе возможностей их комбинирования с другими терапевтическими подходами, а также их частоты введения.

 

01.02.2017 Источники: Статья Mead B. and Tomarev S. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosomes Promote Survival of Retinal Ganglion Cells Through miRNA-Dependent Mechanisms опубликована в журнале Stem Cells Translational Medicine.

Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам National Eye Institute: Stem cell secretions may protect against glaucoma.

 

 

Группа медиков из больницы Грейт Ормонд Стрит (Great Ormond Street Hospital), Лондон, впервые в истории медицины успешно использовала генетически модифицированные донорские иммунные клетки для того, чтобы побороть лейкемию у двух детей, возрастом 11 и 16 месяцев. Использованная медиками технология является расширением стандартной клеточной терапии и в ней используются недорогие донорские универсальные клетки, которые могут быть получены и использованы в любой момент времени.

Разработанная лондонскими медиками технология значительно опережает технологии клеточной терапии, разработанные и применяемые рядом компаний, включая Juno Therapeutics и Novartis. В технологиях этих компаний используются клетки, взятые из организма пациента. И для их использования требуется много времени на их отбор, генную модификацию и введение их обратно в организм пациента.

В своей работе британские медики использовали Т-клетки типа CAR-T, "вечноголодные" клетки-хищники, являющиеся "боевыми единицами" иммунной системы, которые после соответствующих генных модификаций нападают только на клетки, пораженные лейкемией или другими онкологическими заболеваниями. Донорские клетки были подвержены в общей сложности четырем генетическим модификациям, две из которых проводятся при помощи технологии редактирования генома TALENs. Одна из этих модификаций лишает донорскую клетку способности нападать на нормальные клетки тела другого человека, а вторая направляет их "агрессию" строго на раковые клетки.

Несмотря на столь грандиозный успех, в медицинском мире нашлись скептики, которые ставят под сомнение все сделанное британцами. "Оба вылеченных ребенка прошли перед этим стандартный курс химиотерапии" - рассказывает Штефан Групп (Stephan Grupp), директор отделения иммунотерапии Детской больницы Филадельфии, - "Поэтому в данном случае не имеется никаких убедительных доказательств высокой эффективности нового метода. Конечно, было бы замечательно, если бы этот метод оказался рабочим, но нам еще только предстоит убедиться в этом в ближайшем будущем".

Права на новую технологию клеточной терапии были переданы биотехнологической компании Cellectis, а выпуском препаратов занимаются фармацевтические компании Servier и Pfizer. "Любой пациент может получить немедленное лечение при помощи нашего нового метода. В других методах неизбежно возникает задержка, необходимая для взятия, генетической обработки и обратного введения собственного клеточного материала пациенту" - рассказывает Джулианна Смит (Julianne Smith), вице-президент компании Cellectis, курирующий направление развития технологий на базе CAR-T клеток, - "В нашем случае кровь, взятая у донора, может быть превращена в сотни доз, сразу готовых к употреблению. Мы оцениваем, что стоимость производства одной дозы будет составлять 4 тысячи долларов, что гораздо меньше суммы в 50 тысяч, требующихся на получение дозы из собственных клеток пациента".

 

01.02.2017 Источник: dailytechinfo.org

 

Схема строения типичных белковых мотивов «цинковые пальцы». Чаще всего цинковый палец состоит из 20 аминокислот. Ион цинка связан с двумя гистидинами и двумя цистеинами. Рисунки с сайта studopedia.su и из «Википедии».

 

Белковый комплекс под названием шелтерин связывается с теломерными повторами и защищает их от деградации. Однако недавно обнаружили, что у него есть конкурент с менее мягким характером: белок TZAP с одиннадцатью цинковыми пальцами способен специфически связываться с теломерами хромосом, но не оберегать, а обрезать их. В нормальных условиях он клетке помогает, но если дать волю его пальцам, TZAP основательно «пощиплет» теломеры, а это может довести клетку до самоубийства.

Для нормального функционирования клеток эукариот очень важна длина теломер — концевых участков хромосом. Теломеры состоят из коротких повторов ДНК (TTAGGG) и почти 200 белков, выполняющих множество важных функций — от синтеза ДНК до защиты теломеры [1].

До января 2017 года был известен лишь один белковый комплекс, специфически взаимодействующий с ДНК-повторами теломеры, — шелтерин. Но теперь ученые обнаружили еще один белок, обладающий сродством к участкам TTAGGG. Благодаря особым ДНК-связывающим мотивам (см. заглавную картинку) этот белок в зависимости от условий может убить клетку, а может и спасти [1].

 

Теломеры и теломераза

 

У эукариот на концах хромосом формируются специальные структуры, называемые теломерами. Они защищают ДНК хромосом от деградации нуклеазами и различных аберраций. ДНК теломер состоит из коротких консервативных тандемных повторов (рис. 1). У позвоночных, например, тысячи раз повторяется шестинуклеотидный мотив TTAGGG, у насекомых — TTAGG, у большинства растений — TTTAGGG, у грибов длина мотива сильно варьирует [2].

 

Рисунок 1. Хромосома и теломера. Показана последовательность теломерных повторов инфузории. Рисунок с сайта www.gazeta.ru, адаптирован.

 

К сожалению, при удвоении генетического материала клетка не в силах обеспечить полную репликацию теломер. Поэтому после каждого деления у дочерней клетки оказываются хромосомы с чуть более короткими теломерами. Это называется концевой недорепликацией, которую наряду с другими механизмами укорочения теломер, рассматривают в качестве одной из причин старения [3]. Насколько весомую роль играет сокращение теломер в старении человека, пока не ясно, зато очевидно, что оно ведет к репликативному старению клеток и их переходу в сенесцентное состояние. Клетка при этом утрачивает способность к делению и секретирует особый набор веществ, формирующий провоспалительную микросреду, неблагоприятную для соседок и организма в целом.

У млекопитающих средняя длина теломер в молодой клетке — 8–12 т.п.н. А критическая (минимально допустимая) длина человеческой теломеры — 77 нуклеотидов. Дальнейшие деления клетки могут вести к крайне неблагоприятным для нее событиям, включая слияние концов разных хромосом [4].

У большинства эукариот необходимая длина теломер поддерживается теломеразой, которая восполняет потерянные при репликации повторы на 3’-конце ДНК*. Комплементарную цепь при этом достраивает ДНК-полимераза [3].

* — За открытие механизма, защищающего хромосомы от концевой недорепликации с помощью теломер и теломеразы, в 2009 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джеку Шостаку: «„Нестареющая“ Нобелевская премия: в 2009 году отмечены работы по теломерам и теломеразе» [5]. Занимательную информацию по самόй теломерной проблеме можно найти в статьях «Старение — плата за подавление раковых опухолей?» и «Теломеры и новые мишени протоонкогенной терапии» [6, 7]. Интересны также исследования, например, об изменении длины теломер в связи с временем года у растений или в сезон дождей у жителей Коста-Рики: «Длина теломер и времена года» [8]. — Ред.

Теломераза — рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из фермента теломеразной обратной транскриптазы (TERT) и теломеразного РНК-компонента (TERC), который содержит матричную последовательность для удлинения теломеры — 3’-AAUCCC-5’. За один «присест» теломераза может добавлять не один, а сразу несколько теломерных повторов (рис. 2). При последовательном переходе фермента из состояния 1 через состояния 2 и 3 в состояние 4 теломераза добавляет к праймеру один теломерный повтор. Переход 4→2 соответствует добавлению нескольких теломерных повторов без отделения от теломеры (переход 4→1) [3].

 

Рисунок 2. Работа теломеразы. Цифры в рамках обозначают положение теломеразы по отношению к праймеру (3’-концу ДНК теломеры) на различных стадиях: 1 — фермент не связан с праймером; 2 — отжиг праймера; 3 — стадия элонгации; 4 — завершение присоединения одного теломерного повтора. Пунктирными стрелками показаны возможные процессы диссоциации праймера при работе фермента. Условные обозначения: TERT — белковая субъединица с сайтом «заякоривания» теломерной ДНК (серый кружок), TERC — теломеразная РНК с матричным участком (серый прямоугольник). Рисунок из [3].

 

Теломераза не активна в большинстве соматических клеток человека. Хотя РНК-компонент транскрибируется на постоянном уровне почти во всех клетках, в соматических не синтезируется белковая часть — обратная транскриптаза. При искусственной активации экспрессии ее генов культура соматических клеток избегает репликативного старения, то есть клетки приобретают способность делиться неограниченно долго. Теломераза собирается и работает в стволовых, половых и некоторых других типах клеток, которым нужно делиться постоянно (например, клетках эпителия кишечника) [9, 10].

Считается, что активация этого фермента связана с развитием рака: теломераза активна в 85% раковых опухолей, в остальных 15% действуют альтернативные механизмы поддержания длины теломер, основанные на рекомбинации [11, 12].

 

 

Шелтерин

 

Шелтерин, или телосома — комплекс из шести белков, регулирующий активность теломеразы и защищающий теломеры млекопитающих от систем репарации ДНК (рис. 3). Связываясь с повторами TTAGGG на теломерной ДНК, шелтерин способствует образованию на ее конце t-петли — своеобразного «колпачка», прячущего свободный конец хромосомы от репарационных ферментов. Отсутствие или критический недостаток шелтерина в клетке «распечатывает» теломеры, и они становятся доступными нуклеазам и прочим ферментам, подвергаются деструкции и сливаются с концами других хромосом, что в итоге приводит к клеточной сенесценции или апоптозу [13, 14].

 

Рисунок 4. Работа телосомы. а — Структура t-петли. Нависающий 3’-конец заводится между двумя цепями ДНК, формируя D-петлю («петлю замещения», где одна из двух основных цепей ДНК вытесняется вторгшейся цепью, комплементарной второй основной цепи). Размер петли переменный. б — Модель формирования петли шелтерином. TRF1 и TRF2 сгибают теломеру и закрепляют t-петлю. POT1 удерживает одноцепочечные участки ДНК. в — Модель регуляции длины теломеры шелтерином. Пока теломера достаточно длинная, шелтерин закрывает к ней доступ теломеразе. Как только теломера укорачивается до определенной длины и присоединенных шелтеринов становится недостаточно для образования t-петли, теломераза получает доступ к открытому 3’-концу. Рисунок из [15], адаптирован.

 

Если концы теломерных ДНК остаются свободными, активируются системы репарации, которые распознают такие концы как двухцепочечные разрывы. К «оголению» концов может вести, например, недостаток в клетке шелтериновой субъединицы TRF2. Но в то же время в таком открытом состоянии теломеры — отличный субстрат для работы теломеразы, которая достраивает их до необходимой, стабилизирующей длины [14].

 

 

Новый белок, открытый Эросом Лаццерини Денчи и Джулией Су Джоу Ли (рис. 5) — учеными из Исследовательского института Скриппс в США, — наряду с шелтерином играет важную роль в гомеостазе хромосомных теломер. Ученые назвали его теломерным белком с цинковыми пальцами (TZAP, telomeric zinc-finger associated protein).

 

Рисунок 5. Профессор Денчи и студентка Ли. Фотография с сайта www.scripps.edu.

 

Отличительная черта TZAP — 11 цинковых пальцев, которыми он «хватается» за TTAGGG-повторы теломер. При этом оказалось, что для эффективного взаимодействия с ДНК белку необходимы только три последних пальца, Znf9—11 (рис. 6). Связываясь с ДНК, TZAP инициирует «стрижку» теломер: из них вырезаются шестинуклеотидные повторы [1].

 

Рисунок 6. Три последних пальца требуются TZAP для присоединения к теломерной ДНК. Слева —Варианты белка TZAP: целый, с восемью первыми пальцами (Znf1—8) и с тремя последними (Znf9—11). Справа — Эксперимент по взаимодействию трех вариантов TZAP с теломерой. С ДНК связывается лишь целый белок и белок с тремя последними пальцами. Рисунок из [1].

 

TZAP присоединяется к теломерам как в клетках с работающей теломеразой, так и в клетках без нее. При этом белок не нуждается во взаимодействии с компонентами шелтерина [1].

TZAP предпочитает присоединяться к длинным теломерам. Это показали в эксперименте с клетками HeLa: одна их линия содержала теломеры длиной 5 т.п.н., вторая — 20 т.п.н. TZAP соединялся с теломерами второй линии и совсем не проявлял интереса к теломерам из первой. Оказалось, что количество шелтерина (в том числе и его субъединицы TRF2) в клетке постоянно и не зависит от длины теломер. Поэтому на длинных теломерах могут «обнажаться» повторы TTAGGG, свободные от TRF2. К ним-то и тянется своими пальцами TZAP. Причем конкурирует за субстрат он именно с TRF2, а не с TRF1. При повышенной экспрессии гена TRF2 количество присоединенного к ДНК TZAP сокращается [1].

В то же время в клетках с повышенной экспрессией гена TZAP, лишенных теломеразы (как в обычных соматических клетках), хромосомы быстро теряли теломеры (рис. 7). В итоге появлялись клетки с хромосомами вообще без теломер. Видимо, при высокой концентрации TZAP теснит в конкурентной борьбе TRF2, получая возможность ухватиться пальцами за повторы и «подстричь» теломеру «под ноль». А это приводит к печальным последствиям: хромосомным аберрациям, сенесценции клеток и апоптозу [1].

 

Рисунок 7. Эксперимент с гиперэкспрессией TZAP в клетках без теломеразы. а — Хромосомы в обычной клетке (слева) и в клетке с повышенной экспрессией TZAP (справа). Зелеными точками помечены теломеры. б — Процентное соотношение количества хромосом с лишенными теломер концами в обоих вариантах. Рисунок из [1].

 

В клетках с нормальным балансом TRF2/TZAP последнему позволено лишь следить за тем, чтобы теломера не стала слишком длинной. Эту функцию TZAP выполняет и в эмбриональных стволовых клетках: при экспериментальной делеции генов TZAP теломеры в стволовых клетках существенно удлинялись, а после введения экзогенного TZAP возвращались к норме [1].

Известно, что слишком длинные теломеры могут способствовать трансформации клетки в раковую, разрешая ей бóльшее количество делений, чем положено. Получается, что TZAP, регулируя максимальную длину теломер, участвует в защите организма от возникновения опухолей [1]. Но если синтез TRF2 вдруг нарушится, крючковатые пальцы TZAP тут же потянутся к теломерам, чтобы резать, резать и резать... До самой клеточной смерти.

 

30.01.2017 Источник: biomolecula.ru