Рецепторы к EGRF в трех циклах криофиксации: перед, через 5 и 20 минут после активации

Немецкие ученые разработали метод микроскопии молекул в живых клетках с высоким пространственным разрешением. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Methods.

Микроскопия молекул в живой клетке значительно осложнена тем, что они пребывают в постоянном движении. Необратимая химическая фиксация не позволяет наблюдать молекулярные процессы в динамике, неэффективна для иммобилизации мембран, может приводить к экстракции белков и искусственной кластеризации макромолекул.

Сотрудники Института молекулярной физиологии Общества имени Макса Планка, Дортмундского технического университета и Фраунгоферовского института биомедицинской техники разработали метод обратимой фиксации клеток постепенным охлаждением до −45 градусов Цельсия. Скорость охлаждения в эксперименте составила от 35 до 50 градусов в минуту, а последующего нагревания — от 75 до 130 градусов в минуту.

 

 

Для предотвращения кристаллизации льда, гибельной для клетки и рассеивающей свет, биоматериал обрабатывали диметилсульфоксидом (ДМСО). Это вещество хорошо проникает в клетку, малотоксично при низких температурах и вызывает образование сиропообразного аморфного льда (этот процесс называется витрификацией). Чтобы ДМСО не навредил биоматериалу, его концентрацию постепенно увеличивали и уменьшали в ходе охлаждения и согревания.

Такая технология позволяет проводить криофиксацию одной и той же клетки несколько раз, наблюдая за динамикой ее молекулярных процессов. Ученые продемонстрировали ее обратимость на разных клеточных линиях, добившись выживания 80 процентов клеток после трех циклов охлаждения.

В ходе экспериментов криофиксацию применили для изучения самосборки и активации рецепторных тирозинкиназ (РТК) в плазматической мембране, а также формирования их нанокластеров, усиливающих сигнал при взаимодействии с лигандом. РТК (в частности, рецептор эпидермального фактора роста EGFR, связанный с флуоресцентным белком) визуализировали при помощи флуоресценции полного внутреннего отражения и микроскопии локализованной фотоактивации (TIRF-PALM). Получение изображения этим методом требует нескольких минут, за которые при 37 градусах Цельсия рецепторы из-за диффузии смещаются на десятки микрометров. Криофиксация позволила детально рассмотреть их.

Кроме того, пятиминутная активация рецепторов эпидермальным фактором роста после одного цикла охлаждения вызвала эндоцитоз EGFR, который продолжался после двух дополнительных циклов, проведенных через 5 и 20 минут. Это подтверждает, что методика не наносит существенного ущерба молекулярным процессам в клетках.

«Жизнь всегда пребывает в движении, чтобы поддерживать себя, и ее невозможно визуализировать точно. Тем не менее, мы добились этого методом обратимой криофиксации. В узком смысле, мы преодолели биологический принцип неопределенности», — http://phys.org/news/2016-07-outsmart-biological-uncertainty-principle.html">подытожил руководитель исследования Филиппе Бастиенс (Philippe Bastiaens).

Источник: Олег Лищук nplus1.ru

Австралийские медики заявили, что им почти удалось искоренить СПИД в своей стране. Случаи заболевания в последнее время резко сократились.

Органоид, выращенный из клеток рака толстой кишки

Крупные мировые организации по изучению рака запустили проект по производству моделей человеческих опухолей, максимально близких к оригиналам по биологическим характеристикам, для исследовательских целей, говорится в пресс-релизе.

Проект под названием Human Cancer Models Initiative (HCMI) создан и будет финансироваться совместно Национальным институтом рака США (NCI), британскими Cancer Research UK и Wellcome Trust, а также нидерландской некоммерческой компанией Hubrecht Organoid Technology.

Целью HCMI станет использование различных передовых технологий для создания моделей человеческих злокачественных новообразований, которые максимально соответствуют настоящим опухолям по клеточному многообразию и тканевой архитектуре. В частности, планируется использовать искусственные органы (органоиды) из культур клеток на гидрогелевых и других основах, выращивание человеческих раковых клеток на подложке из живых мышиных клеток и другие методики. Основное требование к моделям — развиваться и реагировать на лекарства и другие воздействия аналогично соответствующим формам рака.

Клетки для моделей исследователи будут забирать из образцов опухолей пациентов. Геномы оригинальных раковых клеток и полученных на их основе моделей будут полностью секвенировать, результаты вместе с актуальными клиническими данными пациентов сделают доступными для изучения.

В течение пилотного периода продолжительностью от двух до трех лет планируется создать 1000 моделей (600 силами NCI, 200 — Cancer Research UK и Wellcome Trust и еще столько же — Hubrecht Organoid Technology). Основную часть составят распространенные формы рака, однако NCI попытается смоделировать также редкие и педиатрические опухоли, рассказал директор Центра геномики рака при NCI Луис Штаудт (Louis Staudt). Первые образцы будут доступны для исследований до конца 2016 года. В долгосрочной перспективе проект планируется расширить до 10 тысяч моделей.

«HCMI будет служить преобразующим ресурсом, который даст ученым возможность изучать многие аспекты рака, в том числе неоднородность опухолей, прогрессирование заболеваний, механизмы лекарственной устойчивости и разработку высокоточного направленного лечения», — пишет пресс-служба Cancer Research UK.

В настоящее время большинство онкологических исследований проводится с использованием так называемых бессмертных клеточных линий человеческих опухолей. Этот подход несовершенен, поскольку чистые культуры клеток зачастую отличаются по свойствам от реальных опухолей. Кроме того, при продолжительном воспроизведении в лабораториях (некоторые клеточные линии живут более полувека) клетки могут изменяться и утрачивать первоначальные свойства.

11.07.2016 Источник: Олег Лищук nplus1.ru