Американские и австралийские исследователи провели клинические испытания терапии стволовыми клетками для борьбы со старением. Метод оказался эффективным и безопасным для человека.

Результаты научной работы опубликованы в The Journals of Gerontology (Le Couteur et al., Stem Cell Transplantation for Frailty). Кратко об этом рассказывается на сайте New Atlas.

Специалисты использовали мультипотентные мезенхимальные стромальные стволовые клетки (ММСК). Этот тип клеток находится во взрослом организме и способен дифференцироваться (трансформироваться) в клетки костных, хрящевых и жировых тканей. В ходе процедуры пациенты, средний возраст которых достигал 76 лет, получали ММСК, выделенные из костного мозга доноров 20-45 лет. Шесть месяцев спустя у добровольцев улучшились показатели физической активности и общего качества жизни, а также нормализовался уровень способствующих воспалению белков.

Кроме того, ученые провели рандомизированное двойное слепое испытание с группой контроля, когда испытуемые случайным образом делятся на две группы, в одной из которых все получают плацебо. При этом те, кто непосредственно проводит эксперимент, не знают, кто получает настоящее лекарство, а кто — пустышку. Нежелательных побочных эффектов от терапии стволовыми клетками отмечено не было. В этом случае старение также замедлилось.

 

Подробнее по теме:

Регенеративная медицина, клеточная терапия

 

 

25.10.2017 Источник:lenta.ru

 

Комплекс белка Cas13 с РНК.

 

Недавно открытый белок Cas13a — компонент системы CRISPR/Cas, который способен целенаправленно разрушать молекулы РНК — заставили работать в клетках человека. Ученые из Массачусетского технологического института показали, что при помощи CRISPR/Cas13 можно эффективно уничтожать мРНК выбранных генов, тем самым «выключая» их активность. Неактивную форму Cas13a, способную только связывать, но не расщеплять РНК, ученые приспособили для отслеживания локализации молекул РНК внутри клетки. Исследование опубликовано в Nature.

Часто для оценки влияния конкретного белка на какой-то внутриклеточный процесс, исследователям требуется выключить ген, который его кодирует. Сделать это можно двумя способами — необратимо «сломать» ген, то есть внести в ДНК мутацию, которая нарушит его функцию, либо подавить его активность на уровне транскрипции, то есть синтеза матричной РНК.

В частности, изменить последовательность ДНК можно при помощи системы CRISPR/Cas9, подробней о которой можно прочитать в нашем материале. Эта система состоит из белка Cas9, расщепляющего ДНК, и короткой направляющей РНК, которая «указывает» белку, где ему сделать разрез. В процессе залечивания клеткой разреза в ДНК, в последовательность гена вносится мутация.

Однако эффективность этого процесса не так высока, как хотелось бы, к тому же исследуемый ген может быть настолько важен для жизнедеятельности, что его необратимая поломка несовместима с жизнью. В таких случаях можно временно подавить транскрипцию гена при помощи РНК-интерференции. В основе этого процесса лежат маленькие молекулы РНК, комплементарные участку внутри матричной РНК (они называются малые интерферирующие РНК). Специальный белковый комплекс узнает матричную РНК, связанную с малой РНК, и расщепляет ее.

Эффективность подавления активности гена при помощи РНК-интерференции, как правило, меньше ста процентов, что позволяет работать даже с жизненно важными мишенями. Однако у этого способа есть и недостатки: во-первых, некоторые гены невозможно «заглушить» даже РНК-интерференцией, во-вторых, малые РНК не очень точно связываются со своей мишенью, что приводит к нецелевому уничтожению мРНК.

В прошлом году мы писали об открытии международным коллективом, в который входили и российские ученые, нового белка из семейства Cas, который способен направленно расщеплять одноцепочечную РНК, а не ДНК. Белок получил название С2с2, или Cas13a. В работе, опубликованной в журнале Science, исследователям удалось направленно уничтожить РНК бактериофага в клетках кишечной палочки, а также направить на деградацию мРНК флуоресцентного белка. Кроме того, новый белок был успешно использован для in vitro детекции нуклеиновых кислот в методе под названием SHERLOCK.

В новой работе ученые показали, что Cas13a из бактерии Leptotrichia wadei можно использовать и в клетках человека, а также в клетках растений (в клетках кишечной палочки тестировали белок из другого вида, Leptotrichia shahii), и что система CRISPR/Cas13 может эффективно заменить собой РНК-интерференцию.

Для начала авторы оптимизировали нуклеотидный состав гена Cas13 так, чтобы белок эффективно синтезировался в эукариотических клетках, и «пришили» к нему последовательность, обеспечивающую доставку в ядро. Эффективность расщепления РНК проверили на двух клеточных линиях человека и клетках риса. Эффективность выключения репортерного гена Gluc, кодирующего люциферазу, везде оказалась довольно высокой и составила около 75 процентов.

 

Сравнение эффективности и точности системы CRISPR/Cas13a и системы РНК-интерференции. График слева отражает количество нецелевых (off-target) мишеней для проб, используемых для РНК-интерференции (shRNA) и для CRISPR-выключения генов (LwaCas13a). График справа отражает эффективность выключения генов разными пробами.

 

После этого авторы проверили эффективность системы для подавления активности нескольких собственных генов человека на фибробластах и клетках меланомы. Для разных генов эффективность выключения составила в нескольких экспериментах от 30 до 85 процентов, что в среднем соответствовало эффективности контрольных проб для РНК-интерференции.

При помощи Cas13 авторам работы удалось существенно снизить количество транскриптов для генов, которые с использованием РНК-интерференции подавить не удавалось (MALAT1 и XIST). Важным преимуществом CRISPR/Cas13 перед интерференцией оказалась чувствительность связывания: по сравнению с малыми интерферирующими РНК, для которых было детектировано множество нецелевых мишеней, для Cas13 нецелевого связывания зарегистрировано вообще не было.

Введение мутаций в каталитический домен белка привело к тому, что Cas13a перестал разрезать РНК, и снижения количества транскриптов мишеней не происходило. Способность неактивного мутанта dCas13a специфически связывать молекулы РНК была использована в качестве метода для мониторинга матричных РНК в цитоплазме. Для этого белок dCas13a пришлось модифицировать таким образом, чтобы в отсутствие мишени он был сосредоточен в ядре и подавлял собственную транскрипцию. На примере мРНК гена актина (ACTB) авторы показали, что при помощи dCas13a можно детектировать накопление этих РНК в цитоплазме в составе стрессовых гранул — скоплений, которые образуются в неблагоприятных для клетки условиях. В присутствии направляющей РНК для гена актина dCas13a связывал мРНК этого гена и переходил в цитоплазму, а в присутствии контрольной РНК, которая его никуда не направляла, детектировался в ядре.

 

Модифицированный Cas13a может быть использован для мониторинга мРНК. Для того, чтобы локализовать несвязанный c мишенью белок в ядре, к нему пришили домен связывания с ДНК и репрессорный домен (с). В присутствии направляющей РНК для гена ACTB белок связывается с мРНК гена (d, f). На изображениях, полученных при помощи флуоресцентной микроскопии Cas13a, слитого с зеленым флуоресцентным белком, видно, что мРНК гена ACTB склонна накапливаться в цитоплазме в составе стресс-гранул. NT guide - контрольная направляющая РНК, не соответствующая никакому гену

 

По мнению Константина Северинова, который поучаствовал в открытии нового белка, и интервью с которым мы по этому поводу публиковали, практическое применение в клетках нового Cas-белка с активностью РНКазы было вряд ли возможно. Однако его коллеги довольно быстро показали, что это не так. Станет ли Cas13 таким же популярным и незаменимым лабораторным инструментом, как РНК-интерференция и его «брат» белок Cas9, — время покажет. Ранее ученым удалось заставить белок Cas9 связываться с РНК и расщеплять ее путем искусственной пришивки к нему РНКазы. При помощи варианта этого белка под названием RCas9, авторы смогли уничтожить скопления микросателлитной РНК в клетках, взятых у больных с миодистрофией.

 

Читайте по теме:

Генетики научились редактировать РНК в 900 раз точнее

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

 

06.10.2017 Источник: nplus1.ru

 

Система REPAIR, редактирующая РНК

 

Генетики разработали новую систему для редактирования РНК без разрезания на основе системы CRISPR-Cas13, а затем усовершенствовали ее, снизив количество совершаемых ей ошибок в 900 раз. Исследование опубликовано в Science.

Редактирование РНК, в отличие от ДНК-редактирования, позволяет, во-первых, вносить изменения в клетку в заданные интервалы времени, а во-вторых, не вызывает столько вопросов и проблем, связанных с этикой геномного редактирования в целом. РНК со временем деградирует, и все связанные с ней изменения, таким образом, обратимы. Подробнее о системе CRISPR-Cas13, которая позволяет редактировать РНК, можно прочитать здесь.

Ученые из Гарварда и MIT систематически проанализировали ряд белков семейства Cas13, чтобы отыскать наиболее эффективную форму этого белка, и выбрали кандидата, принадлежащего бактерии рода Prevotella, который назывался PspCas13b. По сравнению со всеми своими ортологами он наиболее эффективно находил и инактивировал нужную РНК, разрезая ее. Это само по себе уже являлось полезной находкой, поскольку новые эффективные «ножницы» можно будет применять в других типах экспериментов. В данном же проекте ученые создали модифицированную форму белка, который успешно находил свою цель, но при этом не был способен ее разрезать.

После этого белок Cas13b «сшивали» с белком ADAR2 — аденозиновой РНК-деаминазой, которая способна превращать аденозин в инозин. Инозин расценивается клеткой как гуанозин — таким образом, этот механизм равносилен замене А на G. В результате нужное место отыскивается с помощью системы CRISPR-Cas13b, но РНК при этом не расщепляется, а подвергается дезаминированию с помощью ADAR2. Эта система получила название REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement); эффективность ее работы составила, в среднем, от 20 до 40 процентов, а в некоторых случаях это число достигло 89 процентов.

 

Схема работы системы REPAIR

 

С помощью методов белковой инженерии ученые затем создали усовершенствованный вариант системы, который они назвали REPAIRv2. Он продемонстрировал в 900 раз большую специфичность к целевым мутациям — таким образом, существенно снизилось количество ошибок редактирования. Для того, чтобы протестировать работу новой системы, были использованы длинные молекулы РНК с известными мутациями. Эффективность работы REPAIRv2 по-прежнему составила от 20 до 40 процентов, но при этом внецелевых мишеней новый вариант практически не затронул. Таким образом удалось, в частности, в культуре клеток HEK293FT отредактировать мутации, вызывающие у человека врожденную апластическую анемию и нефрогенный несахарный диабет .

Система успешно редактирует заданные наборы мутаций, что не может излечить генетические заболевания сами по себе, но может весьма существенно сказаться на их развитии, полагают ученые. Среди заболеваний, которые ассоциированы с мутациями G в A — мышечная дистрофия Дюшенна, болезнь Паркинсона и фокальная эпилепсия.

В будущем ученые собираются повышать эффективность работы системы REPAIRv2 и разработать методики, позволяющие направлять такие системы в заданные ткани.

А о другой работе группы ученых из Гарварда и MIT, опубликованной одновременно и посвященной деаминазам и редактированию, но касающейся ДНК и методики, впервые позволившей превращать пары A-T в пары G-C, вы можете прочитать здесь.

 

 

Читайте по теме:

Новая система CRISPR/Cas13 помогла выключить гены в клетках человека

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

 

 

26.10.2017 Источник: nplus1.ru

 

 

 

Что такое стволовые клетки, как они влияют на жизнь человека и какие заболевания можно вылечить с их помощь? На эти и другие вопросы в интервью проекту "Социальный навигатор" рассказал профессор кафедр стволовых клеток и регенеративной биологии Гарвардской медицинской школы Деррик Росси накануне открытой лекции, организованной Московским физико-техническим институтом.

— Что такое стволовые клетки?

— Существует множество различных стволовых клеток. Например, эмбриональные: они отвечают за формирование тела человека. Такие клетки еще называют плюрипотентными стволовыми клетками — это означает, что они могут превращаться в любой вид тканей нашего организма.

Этот тип клеток существует только на очень ранних стадиях эмбрионального развития организма. Однако это не значит, что на этом история стволовых клеток заканчивается.

Для образования различных тканей организма в течение жизни человеку также необходимы стволовые клетки. Для этого существуют специальные стволовые клетки, которые создают замену старым или умершим клеткам в нашем теле.

Я работаю с теми стволовыми клетками, что образуют кровь, а точнее, те ее компоненты, которые перемещают кислород по нашему телу, борются с инфекциями и так далее. Существует порядка 200 различных клеток крови, которые отвечают за разные функции, и все они появляются всего лишь из стволовой клетки — гемоцитобласта, — которая живет в костном мозге. Их там не так много, но все же они есть.

У этих клеток огромный потенциал. Например, с их помощью можно вылечить лейкемию — рак крови. Возможно, вы слышали о трансплантации костного мозга. Однако на сегодняшний день она используется как средство последней надежды.

— Почему?

— Дело в том, что эта процедура довольно опасная сама по себе. В 10% случаев пересадка костного мозга оказывается летальной для пациента.

Ведь сначала человека подвергают жесткой химиотерапии или облучению радиоактивными или гамма-лучами, чтобы убить все клетки крови, а затем вводят новые, которые могут восстановить костный мозг и начать воспроизводство крови заново. При этом надо понимать, что если хоть одна клетка останется в организме человека, то болезнь вернется.

Новые стволовые клетки крови берутся у донора. Точнее, часть его костного мозга пересаживают больному. Донору даже не обязательно быть близким родственником: главное, чтобы у него и реципиента был высокий уровень совместимости. Точнее, так: чем выше, тем лучше.

Однако стоит понимать, что высокая совместимость — все равно не идеальная, поэтому будут элементы несовпадения. Из-за этого клетки донора могут начать атаковать организм реципиента, что приведет к такому заболеванию, как реакция "трансплантат против хозяина". Это очень страшная болезнь. Чем хуже совместимость, тем хуже заболевание. Именно поэтому изначально, более полувека назад, трансплантацию проводили лишь среди однояйцевых близнецов, у которых идеальная совместимость.

— Как определить степень совместимости?

— Она определяется с помощью генетического анализа системы тканевой совместимости, которая в организме представлена набором белков, находящихся на поверхности практически всех клеток организма. С их помощью последние определяют своих и чужих.

— Насколько сложно найти донора с высоким уровнем совместимости?

— По-разному, для кого-то сложно, для кого-то нет. Какие-то типы чаще встречаются, какие-то реже.

При исследовании системы тканевой совместимости человека проверяют по десяти параметрам. А вообще все просто: чем больше доноров, тем больше шанс найти высокий уровень совместимости.

— Как берут костный мозг у донора и сколько его нужно для успешной операции?

— В этой процедуре важно не количество костного мозга, а количество стволовых клеток. В костном мозге, как я уже говорил, их не так много: примерно одна клетка из 20 тысяч будет стволовой. Но, например, в бедренной кости около 10 миллиардов клеток, так что стволовых клеток там достаточно.

Что касается необходимого для операции количества, одной истинной гемопоэтической стволовой клетки достаточно, чтобы восстановить процесс образования крови, но пока стволовая клетка разгонится и даст всех предшественников, могут пройти месяцы! Поэтому нужно переносить не только стволовые клетки, но и дифференцирующиеся из них предшественники, которые могут на короткий срок восстановить систему кроветворения, но очень быстро. Это как выпечка: вы можете купить готовый продукт, полуфабрикат, исходный продукт или построить ферму. Гемопоэтические клетки — это ферма, и пока она заработает в полную силу, вы умрете с голода.

Нужные стволовые клетки также есть в пуповинной крови, но их там слишком мало: не хватит даже для крупного ребенка, а что уж говорить о взрослом.

Поэтому для данной операции клетки берут из костного мозга. Существует два способа получить их. Первый — когда у человека под общей анестезией с помощью специальной огромной иглы из подвздошной кости, точнее, из ее гребня, высасывают часть костного мозга.

Второй — когда с помощью определенных белков, которые дают донору, выводят стволовые клетки из костей в кровь. Далее с помощью специального аппарата их оттуда забирают. Но чтобы таким образом получить достаточное количество стволовых клеток, нужно проводить процедуру на протяжении пяти дней подряд.

— Может ли это как-то навредить донору?

— Нет. Во время процедуры с белками возможна небольшая кратковременная боль в костях.

Если же говорить о процедуре с иглой, то будет немного больно и дискомфортно после процедуры. Однако что такое немного дискомфорта и боли в сравнении с тем, что вы можете подарить кому-то жизнь?

— В июле новостные агентства писали об эксперименте, когда мышам, если не ошибаюсь, вводили стволовые клетки в гипоталамус, что увеличило скорость регенерации всех клеток в организме и, соответственно, замедлило старение. Вы слышали об этом?

— Честно говоря, нет.

Однако иногда в науке какие-то, казалось бы, фантастические вещи оказываются правдой. Да и в целом наука — это открытие неизведанного, а природа удивляет нас постоянно. Никогда не говори никогда. Это особенно актуально для биологии и науки в целом. Если кому-то что-то удалось, кто-то обязательно попытается повторить эксперимент. Так работает наука. В этом и состоит ее прелесть: она всегда проверяет себя.

Вот, например, японский ученый Синья Йаманака обнаружил, что можно взять любую клетку в организме и превратить ее в стволовую. Он взял маленький кусочек кожи мыши, получил из него отдельную клетку, фибробласт. Затем Йаманака понял, что если провести ряд генетических манипуляций, то можно перепрограммировать ее в стволовую клетку, которая может превратиться в любой вид ткани. По факту он получил плюрипотентные стволовые клетки, однако назвал их индуцированными стволовыми клетками.

Благодаря этому открытию ученые научились превращать любую клетку организма в плюрипотентную, которая в свою очередь может трансформироваться в любую другую.

До этого открытия любой ученый сказал бы, что клетка кожи — это клетка кожи и ничем другим никогда не будет. Своеобразная догма. Но Йаманака опровергнул это.

Свой доклад он опубликовал в 2006 году, а в 2012-м получил за это открытие Нобелевскую премию.

— Если можно превратить любую клетку в любую, то почему эта технология не используется при лечении той же лейкемии?

— Мы можем взять любую клетку и спокойно превратить в плюрипотентную стволовую клетку, да. Однако вот сделать из нее стволовую клетку крови — куда более сложная задача. Многие лаборатории в мире сейчас работают над тем, как "уговорить" плюрипотентную стволовую клетку превратиться в нужную. Мы просто не знаем пока тех правил, которые позволят это делать.

— Что вы можете сказать о применении стволовых клеток в косметологии?

— Единственная клинически доказанная процедура со стволовыми клетками — это пересадка костного мозга. Все!

В мире очень много псевдонаучных клиник, который обещают вернуть молодость, красоту и много всего с помощью стволовых клеток. Клинически ничего подобного доказано не было. Это полная чушь! Вас просто хотят развести на деньги.

Единственное, на что можно надеяться, идя на такую процедуру, — это что вам не навредят. Повезет, если они дадут вам солевой раствор. Поверьте, вы не хотите, чтобы они давали вам стволовые клетки, ведь эти горе-врачи не знают, что делают.

Не верьте тому, что вы читаете в интернете.

— Как вы думаете, какие перспективы существуют у стволовых клеток в медицине?

— Да кто ж его знает-то, настоящий потенциал? До 2006-го все думали, что невозможно из одной клетки другую получить.

Как скоро стволовые клетки начнут применять на повседневной основе в медицине? На сегодняшний момент проводится около 40 тысяч операций по пересадке костного мозга в год. Мы пытаемся увеличить этот показатель. Если сделать операцию более безопасной, то в перспективе можно будет лечить и другие заболевания, например ВИЧ.

Слышали про "берлинского пациента"? Это единственный на земле человек, которого смогли вылечить от ВИЧ-инфекции. Зовут его Тимоти Браун. Дважды ему очень крупно не повезло, а один раз невероятно повезло. В 1995 году у мужчины нашли ВИЧ, в 2006-м — лейкемию. Для него нашли донора с мутацией гена CCR5, который делает человека невосприимчивым к ВИЧ. Данная мутация встречается у небольшого числа европейцев (примерно у 10% есть вариант гена delta32, и только у 1% он присутствует в двойном наборе, что делает таких людей резистентными к ВИЧ-1). В 2007 году Тимоти Брауну провели пересадку костного мозга, благодаря чему он победил лейкемию, а затем и ВИЧ. Этот факт неоднократно был подтвержден.

Беседовал Константин Ермолаев

 

 

Подробнее по теме:

Регенеративная медицина, клеточная терапия

 

27.10.2017 Источник: ria.ru