Блог новостной категории

Универсальный возраст по метилированию ДНК в тканях млекопитающих (препринт)

Новые результаты

Комплекс ДНК-метилтрансферазы с ДНК

Старение часто воспринимается как дегенеративный процесс, вызванный случайным накоплением клеточных повреждений с течением времени. Несмотря на это, возраст можно точно определить с помощью эпигенетических часов на основе профилей метилирования ДНК практически любой ткани тела. Поскольку такие пан-тканевые эпигенетические часы были успешно разработаны для нескольких разных видов, трудно игнорировать вероятность того, что вместо этого в основе процесса старения лежит определенный и общий механизм. Чтобы прояснить этот вопрос, мы создали 10 000 массивов метилирования, каждый из которых профилирует до 37 000 цитозинов в высококонсервативных участках ДНК из более чем 59 типов тканей, происходящих от 128 видов млекопитающих. На основании этих данных мы идентифицировали и охарактеризовали специфические цитозины, уровни метилирования которых изменяются с возрастом у разных видов млекопитающих. Гены, связанные с этими цитозинами, в значительной степени участвуют в процессах развития млекопитающих и участвуют в возрастных заболеваниях. На основе профилей метилирования этих возрастных цитозинов мы успешно сконструировали три вида универсальных высокоточных часов для плацентарных млекопитающих и одни универсальные часы для сумчатых.
Универсальные часы для плацентарных с одинаковой точностью оценивают возраст (r> 0,96) любого вида млекопитающих и любой ткани с помощью одной математической формулы. В совокупности эти новые наблюдения подтверждают идею о том, что старение действительно эволюционно консервативно и связано с процессами развития у всех видов млекопитающих - идея, которая обсуждалась задолго до получения этих новых убедительных доказательств.

Оригинальная статья: Universal DNA methylation age across mammalian tissues

Введение

Старение связано с множественными клеточными изменениями, которые часто зависят от ткани. Однако метилирование цитозина в этом отношении необычно, поскольку оно сильно коррелирует с возрастом практически во всех тканях. Эта функция может быть использована для разработки многомерных оценок возраста (пан-тканевых эпигенетических часов), которые применимы к большинству или ко всем тканям вида. Этот подход позволил создать первые пан-тканевые часы человека, основанные на 353 связанных с возрастом CpG-1. Последующие успехи в разработке подобных пан-тканевых часов для других видов намекают на универсальность процесса старения. Чтобы исследовать это, мы стремились 1) -идентифицировать и охарактеризовать цитозины, уровни метилирования которых изменяются с возрастом у всех млекопитающих, и 2)-разработать универсальные средства оценки возраста, которые применимы ко всем видам и тканям млекопитающих (универсальные эпигенетические часы для млекопитающих). С этой целью мы использовали новый массив Infinium (HorvathMammalMethylChip40), который профилирует уровни метилирования до 37000 CpGs с фланкирующими последовательностями ДНК, которые являются высококонсервативными у класса млекопитающих ².

Прим. Фланкирующие области, фланкирующие последовательности (flanking regions, flanking sequences) [англ. flank — бок, сторона, фланг] — области (нуклеотидные последовательности) ДНК, располагающиеся по обе стороны («по соседству», «на фланге») от специфического локуса, гена или какой-нибудь иной нуклеотидной последовательности.

Мы получили такие профили почти из 10 000 образцов 59 типов тканей, полученных от 128 видов млекопитающих, представляющих 15 филогенетических порядков (дополнительные таблицы 1.1–1.5) с возрастом от пренатального до 139-летнего (гренландский кит). Испытанные виды имели максимальную продолжительность жизни от 3,8 до 211 лет и вес взрослой особи от 0,004 до 100 000 кг.

Чтобы определить возраст-связанные CpG, мы провели двухэтапный мета-анализ по видам и тканям. Было обнаружено, что цитозины, которые становятся все более метилированными с возрастом (т.е. положительно коррелируют), более консервативны (рис. 1а). Из них мы идентифицировали 665 возраст-связанных CpG в пределах пороговой значимости a = 10в-200 для всех видов животных и тканей (рис. 1а, дополнительная таблица 2.1). Цитозины cg12841266 (P = 6,2 × 10в-908) и cg11084334 (P = 2,0 × 10в-823), расположенные в экзоне 2 гена LHFPL4, были наиболее предсказуемыми для всех видов, имея корреляцию> 0,8 у 24 видов (дополнительная таблица 3), три из которых показаны на рис. 1b-d. Другой высококоррелированный цитозин, cg09710440, находится в LHFPL3 (P = 5.1 × 10в-724), паралоге LHFPL4 (Fig. 1a, Extended Data Fig. 1, Supplementary Table 2.1).

Поскольку LHFPL4 и LHFPL3 находятся в человеческих хромосомах 2 и 7 соответственно, их возрастное усиление метилирования вряд ли случайно. Напротив, это подразумевает их участие в процессе старения, даже если механизм участия их активности в качестве нуклеаторов рецепторов ГАМК в этой связи не сразу очевиден. В самом деле, метилирование LHFPL4 cg12841266 сильно коррелировало с возрастом нескольких тканей мыши как на стадии развития (r = 0,58 и P = 8,9 × 10в-11), так и на стадии пост-развития (r = 0,45 и P = 2,3 × 10в-76). особенно в головном мозге (r = 0,92 и P = 6,95 × 10в-8), мышцах (r = 0,89 и P = 7,6 × 10в-7), печени (r = 0,79 и P = 1,9 × 10в-117) и крови (r = 0,89 и P = 1,0 × 10в-53, расширенные данные рис. 2). В соответствии с повышенным метилированием, экспрессия как LHFPL4, так и LHFPL3 снижается с возрастом во многих, хотя и не во всех тканях человека и мыши (дополнительные таблицы 4.1-4.4). В частности, их пониженная экспрессия постоянно наблюдается в головном мозге ^3,4. Важно отметить, что связанные с возрастом изменения метилирования у молодых животных согласованы с изменениями, наблюдаемыми у животных среднего или старого возраста, исключая вероятность того, что изменения связаны исключительно с процессом развития организма (расширенные данные, рис. 3 и 4).

Рисунок 1. Мета-анализ хронологического возраста по видам и тканям. а - значение p мета-анализа (преобразование -log по основанию 10) в зависимости от положения в хромосоме (ось x) согласно сборке 38 генома человека (Hg38). Верхняя и нижняя панели манхэттенского графика изображают CpG, которые с возрастом усиливают / теряют метилирование. CpG, окрашенные в красный и синий цвета, демонстрируют высокозначимые (P <10в-200) положительные и отрицательные возрастные корреляции соответственно. Наиболее значимый CpG (cg12841266, P = 9,3 × 10в-913) расположен во 2 экзоне гена LHFPL4 у человека и большинства других видов млекопитающих, за которым следует cg11084334 (P = 1,3 × 10в-827). Эти два CpG и cg097720 (P = 4,3 × 10в-725), расположенные в гене паралога LHFPL3, отмечены пурпурными ромбами. Графики разброса cg12841266 (по оси x) в зависимости от хронологического возраста для b, мини-свиней (Sus scrofa minusculus), c, мыши Oldfield (Peromyscus polionotus) и d, верветки (Chlorocebus aethiops sabaeus), соответственно. Образцы тканей помечены индексом видов млекопитающих и окрашены по типу ткани, как подробно описано в дополнительной таблице 1s. Панели e-g: аннотации 1000 лучших гиперметилированных и гипометилированных CpG, перечисленных в метаанализе EWAS по всем (результаты на панели a), тканям мозга, крови, печени и кожи, соответственно. e, диаграмма Венна отображает перекрытие связанных с возрастом CpG в разных органах на основе EWAS из 1000 самых гиперметилированных / гипометилированных CpG. Мы перечисляем все 36 генов, которые являются ближайшими к 54 возрастным CpG, общим для всех органов на диаграмме Венна. е, столбиковые диаграммы отображают ассоциации результатов EWAS (мета-баллы Z) с островками CpG (внутри / снаружи) в различных типах тканей. Мы перечисляем главные гены для каждого бара. g, Избранные результаты анализа обогащения GREAT. Цветовой градиент основан на -log10 (гипергеометрическое значение P). Размер точек отражает количество общих генов.

Мета-анализ возраст-связанных CpG в определенных тканях

Чтобы получить более широкое и глубокое понимание возраст-связанных CpG в определенных тканях у разных видов, мы сосредоточились на 5 органах: головном мозге (целом и коре), крови, печени, мышцах и коже. Мы выполнили метаанализ EWAS на 851 головном мозге (17 видов), 391 коре головного мозга (6 видов), 3552 крови (28 видов), 1221 печени (9 видов), 345 мышцах (5 видов) и 1452 коже (31 вид). . Постоянно во всех тканях было больше CpG с положительной корреляцией с возрастом, чем с отрицательной (расширенные данные, рис.1), и большинство из них располагалось внутри островков CpG, которые, как известно, становятся все более метилированными с возрастом (рис. 1f, дополнительные таблицы). 2.2-2.7). Хотя многие из этих цитозинов были либо специфичными для отдельных органов, либо общими для нескольких органов, 54 потенциальных универсальных возрастных CpG были общими для всех пяти органов (Fig. 1e, Extended Data Table 1). Поразительно, что подавляющее большинство из 36 генов, которые расположены проксимальнее этих 54 CpG, кодируют факторы транскрипции гомеобокса и участвуют в процессах развития (Extended Data Table 1).

Анализ функционального обогащения возраст-связанных CpG

Мы использовали инструмент обогащения путей (гипергеометрический тест GREAT, основанный на геномных регионах⁵), чтобы проанализировать первые 1000 положительно и 1000 отрицательно коррелированных возрастных CpG и их проксимальных генов во всех тканях, индивидуально или в совокупности, чтобы установить, связаны ли они с конкретными биологическими процессами или клеточными путями (рис. 1g, дополнительные таблицы 5.1-5.15). Мы продемонстрировали, что наши результаты обогащения не противоречат особой конструкции массива метилирования млекопитающих (дополнительная информация, примечание 2). Из положительно коррелированных CpG во всех тканях наиболее обогащенным (P = 3,7 × 10в-207) термином генной онтологии был термин «развитие нервной системы», который также заметно проявлялся в крови (P = 4,7 × 10в-230), печени (P = 7,6 × 10в-136), мышцы (P = 1,4 × 10в-12), кожа (P = 5,4 × 10в-141), мозг (P = 1,0 × 10в-42) и кора (P = 7,5 × 10в-80 ). Другие термины, получившие наибольшее количество баллов, включают «определение паттерна» и «развитие анатомической структуры» (таблица 2 с расширенными данными и дополнительная таблица 5s). Очевидно, многие гиперметилированные возраст-связанные CpGs во всех пяти органах могут быть проксимальнее генов развития. На молекулярном уровне многие из этих CpG находятся в позициях, таргетированных SUZ12, который является одной из основных субъединиц ингибиторного комплекса 2 группы поликомб (вся ткань P = 7,1 × 10в-225, кровь P = 3,9 × 10в-259, P печени = 1,7 × 10–149, мышцы P = 8,2 × 10–16, кожа P = 2,6 × 10–150, мозг P = 8,7 × 10–54 и кора головного мозга P = 6,1 × 10–87); перекликаясь с предыдущими исследованиями EWAS на людях^6,7. EED, другая основная субъединица PRC2, демонстрирует столь же высокие значимые P-значения, например P = 1,7 × 10в-262 во всех тканях (таблица расширенных данных 2). Сильное обогащение можно также обнаружить в промоторах с модификацией H3K27me3. Они наблюдались во всех тканях (P = 2,8 · 10в-266), крови (P = 3,9 · 10в-283), печени (P = 3,3 · 10в-189), мышцах (P = 8,7 · 10в-18), коже. (P = 3,3 × 10–189), головного мозга (P = 3,3 × 10–68) и коры головного мозга (P = 5,1 × 10–116) (таблица расширенных данных 2). Эти результаты подтверждают связь между развитием и старением. Это может показаться нелогичным, но находит подтверждение в том факте, что мыши с развитием, нарушенным вследствие удаления рецепторов гормона роста (GHRKO) , демонстрируют значительное замедление процесса старения ⁸. Мы продемонстрировали, что универсальные эпигенетические часы замедляются в коре головного мозга, печени и почки мышей GHRKO (расширенные данные рис. 4).

Интересно, что хотя было обнаружено 3617 обогащений гиперметилированных возраст-связанных CpG во всех тканях, но найдено только 12 гипометилированных. На кажущуюся нехватку последних влияет асимметрия обогащения, которая особенно сильна в коже, крови и печени (дополнительная таблица 5.1). Однако это не относится к мозгу, мозжечку, коре и мышцам, где вместо этого было большее обогащение гипометилированными возрастными цитозинами; тенденция, которая, по-видимому, соответствует скорости обновления тканей. Цитозины, которые были отрицательно связаны с возрастом в головном мозге и коре, но не в коже, крови и печени, обогащены путем циркадного ритма (P ≥ 9,0 × 10в-18, дополнительные таблицы 5.5, 5.7, таблица с расширенными данными 2), Это указывает на то, что помимо общих процессов развития, которые повсеместно участвуют в старении всех тканей, явно действуют и органоспецифические.

Другим важным наблюдением является обогащение отрицательных возраст-связанных цитозинов в активном наборе генов при болезни Альцгеймера. Это наблюдалось во всем головном мозге (P = 2,1 × 10в-30, таблица расширенных данных 2), коре (P = 5,9 × 10в-22) и в мышечной ткани (P = 2,5 × 10в-5). Хотя этот набор генов также был обогащен в крови (P = 1,5 × 10в-6) и всех тканях вместе (P = 1,4 × 10в-4), он был связан с положительными возраст-связанными CpG, вместо этого указывая на то, что на некоторые наборы возрас-связанных генов могут влиять отрицательные и положительные возраст-связанные CpG, потенциально влияя на разные составляющие набора или, возможно, имея противоположные результаты транскрипции в результате метилирования. Другой очень важный пример этого - наблюдение, касающееся функции митохондрий. В то время как гипометилированные возрастные цитозины в мозге, коре и мышцах обогащены многочисленными генами, связанными с митохондриями; однако в крови и коже они обогащены положительными возрастными цитозинами (Таблица расширенных данных 3).

Частичное пересечение возраст-связанных цитозинов с человеческими особенностями и заболеваниями

Чтобы выявить потенциальную корреляцию между возраст-связанными цитозинами и известными человеческими особенностями, проксимальные области генома тех же верхней тысячи положительно ассоциированных и верхней тысячи отрицательно ассоциированных CpG были сопоставлены с верхними 5% генов, идентифицированными GWAS как связанных с многочисленными человеческими особенностями. При пороге P <5,0 × 10в-4 были обнаружены совпадения с генами, связанными с долголетием, болезнью Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона, деменцией, ускорением эпигенетического возраста, возрастом менархе, длиной теломер лейкоцитов, воспалением, долголетием матери, метаболическими заболеваниями, ожирением. (распределение жира, индекс массы тела) и т. д. (Расширенные данные рис. 5, дополнительные таблицы 6.1-6.7); многие из них связаны с пожилым возрастом.

Разработка универсальных пан-тканевых эпигенетических часов возраста для млекопитающих

Выявив связанные с возрастом цитозины, общие для разных видов и тканей млекопитающих, мы приступили к их использованию для разработки универсальных эпигенетических часов для определения возраста млекопитающих. Мы разработали три универсальных измерителя возраста млекопитающих, которые различаются по выходным данным. Первые универсальные наивные часы (Часы 1) напрямую коррелируют профиль метилирования ДНК с хронологическим возрастом. Чтобы дать возможность биологически значимого сравнения между видами с очень разной продолжительностью жизни, мы разработали вторые универсальные часы, которые определяют индивидуальный возраст относительно максимальной продолжительности жизни его вида; генерирование оценок относительного возраста между 0 и 1. Поскольку точность этих универсальных часов относительного возраста (Часы 2) может быть скомпрометирована у видов, для которых данные о максимальной продолжительности жизни недоступны, были разработаны третьи универсальные часы, которые не учитывают максимальную продолжительность жизни и вместо этого используют средний возраст половой зрелости. Возраст половой зрелости был выбран в качестве характеристики вида, поскольку он сильно коррелирует с максимальной продолжительностью жизни по логарифмической шкале (корреляция Пирсона r = 0,82, p = 6 × 10в-183 для всех видов млекопитающих в AnAge). Эти третьи часы называются универсальными лог-линейно преобразованными часами возраста (Часы 3).

Характеристики универсальных эпигенетических часов для разных видов

Мы использовали две разные стратегии для оценки точности часов. Во-первых, перекрестный проверочный анализ с исключением одной фракции (LOFO) случайным образом разделил набор данных на 10 фракций, каждая из которых содержала одинаковые пропорции видов и типов тканей, а для проверки на каждой итерации анализа одна из фракций не учитывалась. Во-вторых, анализ исключения одного вида (LOSO) аналогичным образом подвергался перекрестной проверке с исключением вида на каждой итерации.

Согласно перекрестной проверке LOFO, эпигенетические часы были чрезвычайно точными (r> 0,96), со средней ошибкой менее 1 года и средней относительной ошибкой менее 3,5% (рис. 2a, 3a-b, таблица расширенных данных 4). ). Согласно оценке LOSO, часы достигли возрастных корреляций до r = 0,94 (Таблица расширенных данных 4). Медианная корреляция (и MAE) между видами была столь же сильной при оценках LOFO или LOSO. Однако для некоторых видов, таких как гренландские киты, эпигенетический возраст, предсказанный наивными часами, плохо согласуется с хронологическим возрастом (рис. 2b). Мы исследовали и установили, что средняя разница между LOSO DNAmAge и хронологическим возрастом отрицательно коррелирует с максимальной продолжительностью жизни (r = -0,57, p = 3 × 10в-6) и возрастом половой зрелости (r = -0,5, p = 6,4 × 10). -5) вида (рис. 2в-г). Здесь сила часов 2 выходит на первый план, поскольку на них не влияет максимальная продолжительность жизни, заложенная при их изготовлении. Часы 2 и часы 3 достигают корреляции r = 0,96 и r = 0,95 между DNAm и наблюдаемым относительным возрастом, соответственно (рис. 3d, e). И те и другие часы представляют сравнительно точные оценки LOFO для многочисленных типов тканей у 58 видов (дополнительная таблица 8.2), с представлением на рис. 3g-i корреляций LOFO Clock 2 для людей (r = 0,961, 19 тканей), мышей (r = 0,954, 25 тканей) и афалины (r = 0,95, 2 ткани). В то время как часы точно предсказывали возраст одного вида усатого кита, горбатого кита и всех других видов млекопитающих, возраст образцов гренландского кита иногда недооценивался (видовой индекс 3.11 на рис. 3a, b). Это может просто отражать неточность оценок возраста, используемых для гренландских китов, которые были выдержаны с использованием скорости рацемизации аспарагиновой кислоты. Эти часы также точны с оценками возраста по LOSO для эволюционно далеких видов (дополнительная таблица 9.2), включая собак (r = 0,917, MAE = 1,3), слонов саванны (r = 0,962, MAE <3 лет) и летучих лисиц (r = 0,982, MAE = 1,2) (рис. 3j-l). Такая высокая прогностическая точность анализа LOSO демонстрирует, что эти универсальные часы применимы к видам млекопитающих, которые не являются частью обучающих данных (дополнительные таблицы 9.1, 9.2). Трое универсальных часов показали такие же хорошие результаты у 63 видов, для которых было меньше 15 образцов (r ~ 0,9, MAE ~ 1 год, расширенные данные, рис. 6a-c), что показывает очень сильную корреляцию между расчетным и фактическим относительным возрастом ( r = 0,92, расширенные данные рис. 6г).

Рисунок 2. Naîve universal clock for log-transformed age.a, b, Chronological age (x-axis) versus DNAmAge estimated using a, leave-one-fraction-out (LOFO) b, leave-one-species-out (LOSO) analysis. The grey and black dashed lines correspond to the diagonal line (y=x) and the regression line, respectively. Each dot (tissue sample) is labelled by the mammalian species index (legend). The species index corresponds to the phylogenetic order, e.g. 1=primates, 2=elephants (Proboscidea), 3=cetaceans etc. The number after the decimal point denotes the individual species within the phylogenetic order. Points are colored according to designated tissue color (Supplemental Table 1.3). The heading of each panel reports the Pearson correlation (cor) across all samples. The med.Cor (or med.MAE) is the median across species that contain 15 or more samples. c-f, Delta age denotes the difference between the LOSO estimate of DNAm age and chronological age. The scatter plots depict mean delta age per species (y-axis) versus c, maximum lifespan observed in the species, d, average age at sexual maturity e, gestational time (in units of years), and f, (log-transformed) average adult weight in units of grams.

Рисунок 3. Универсальные часы трансформированного возраста млекопитающих.На рисунке показаны оценки относительного возраста универсальными часами 2 (Clock 2), оценки универсальных часов 3 (Clock 3) лог-линейной трансформации возраста и оценки сумчатых часов (Marsupial Clock) относительного возраста образцов эвтерианов и сумчатых соответственно. Оценка относительного возраста включает максимальную продолжительность жизни и гестационный возраст и принимает значения от 0 до 1. Логлинейный возраст рассчитывается исходя из возраста половой зрелости и срока беременности. Оценки возраста DNAm (оси y) пунктов (a) и (b) представляют собой преобразование относительного возраста (Часы 2 и Часы для Сумчатых) или лог-линейного возраста (Часы 3) в единицы лет. a-f, возраст, оцененный с помощью перекрестной проверки с исключением одного-дробного (LOFO) для часов 2 (a, d), часов 3 (b, e) и часов сумчатых (c, f). g-i, возраст, оцененный с помощью перекрестной проверки LOFO в часах 2. j-l, возраст, оцененный с помощью перекрестной проверки исключения одного вида (LOSO) для часов 2. Мы сообщаем оценки коэффициента корреляции Пирсона. Медиана корреляции (med.Cor) и медиана средней абсолютной ошибки (med.MAE) рассчитываются по видам (a-f) или по видам-тканям (g-i). Каждый образец помечен индексом вида млекопитающих и отмечен цветом ткани (рис. 2, дополнительные таблицы 1.1–1.2).

Что касается сумчатых, мы столкнулись с двумя ограничениями. Во-первых, менее половины CpG эвтерианов применимы к сумчатым ². Во-вторых, в нашем наборе данных было всего семь видов сумчатых с общим размером выборки N = 162. Несмотря на эти ограничения, мы все же смогли построить четвертые универсальные часы для оценки относительного возраста сумчатых (возрастная корреляция, r = 0,88, med.Cor = 0,87 на рис. 3c, f).

Оценка эффективности универсальных эпигенетических часов в тканях

Поскольку ландшафт эпигенома заметно меняется в зависимости от типов тканей ^9,10, мы оценили тканеспецифическую точность часов 2 для относительного возраста (r = 0,96, рис. 3d). Из 33 различных типов тканей медиана корреляции составляет 0,94, а медиана MAE для относительного возраста - 0,026 (дополнительная таблица 8.3). Была высокая корреляция с возрастом для всего мозга (r = 0,987), коры (r = 0,972), гиппокампа (r = 0,964), полосатого тела (r = 0,956), мозжечка (r = 0,975), селезенки (r = 0,981), и почка (r = 0,979) (рис. 4). Кровь и кожа также показали одинаково высокие оценки относительных возрастных корреляций у разных видов: кровь (r = 0,958, MAE = 0,018, 74 вида) и кожа (r = 0,948, MAE = 0,026, 56 видов) (рис. 4i, n).

Рисунок 4. Универсальные часы относительного возраста применительно к определенным тканям. Конкретный тип ткани или клетки указан в заголовке каждой панели. Оценки относительного возраста на основе метилирования ДНК (ось y) по сравнению с фактическим относительным возрастом (ось x). Каждая точка представляет собой образец ткани (окраска соответствует опредененной ткани) и помечена индексом видов млекопитающих (дополнительные таблицы 1.2–1.3). Анализ ограничен тканями, в которых доступно не менее 15 образцов. Перекрестная проверка с исключением одной папки (LOFO) использовалась для получения объективных оценок показателей точности прогнозов: медианы абсолютной ошибки (MAE) и возрастной корреляции на основе относительного возраста. «Cor» обозначает коэффициент корреляции Пирсона, основанный на всех доступных выборках. «Med.Cor» обозначает медианные значения для всех видов, для которых было доступно не менее 15 образцов. Заголовок выделяется синим цветом, если тип ткани был взят от одного вида.

Обсуждение

Универсальность старения у всех видов млекопитающих породила предположения о его причине, с преобладающим представлением о том, что в основе этого процесса лежит случайное повреждение клеточных компонентов. Однако способность точно оценивать возраст млекопитающих на основании их профилей метилирования повышает вероятность детерминированного процесса. Мы исследовали этот вопрос, сгенерировав беспрецедентно большой набор профилей метилирования ДНК из более чем 121 вида эвтерианов и 7 видов сумчатых, из которых возникла однозначная характеристика. Гены, которые являются ближайшими к возрастным CpG, в подавляющем большинстве представляют гены, участвующие в процессе развития, такие как HOX и PAX. Это согласуется с обогащением этих цитозинов в сайтах-мишенях PRC2 и доменов двухвалентного хроматина, которые контролируют экспрессию HOX и др. генов развития у всех позвоночных и не только. Таким образом, похоже, что старение встроено в жизнь через процессы, связанные с развитием.

Большое количество литературы связывает рост / развитие со старением, начиная с основополагающей работы Williams 1957¹¹. Эта связь также очевидна, когда опосредованная факторами Яманака реверсия взрослых клеток в эмбриональные стволовые клетки сопровождается изменением их возраста до пренатального эпигенетического возраста, в соответствие с их стадией развития ¹. Следовательно, регуляция метилирования генов, участвующих в развитии (во время и после периода развития), может составлять ключевой механизм, связывающий рост и старение. Универсальные эпигенетические часы демонстрируют, что старение и развитие взаимосвязаны и разделяют важные механистические процессы, которые действуют на протяжении всей жизни организма.

Другие примечательные возраст-связанные гены и процессы, которые были обнаружены, включают LHFPL4 и LHFPL3, чья заявленная функция в синаптической кластеризации рецепторов ГАМК не сразу представляет очевидную связь со старением во всех тканях. Однако чрезвычайно сильная корреляция CpG вблизи этих паралогов (расположенных на разных хромосомах) с возрастом убедительно свидетельствует об их роли в процессе старения. Ген LARP1 занимает первое место в печени и второе во всех тканях по гипометилированию с возрастом и кодирует белок, который регулирует трансляцию нижестоящих мишеней mTOR, который имеет очень хорошо задокументированные связи со старением и долголетием. Участие генов циркадных ритмов исключительно в стареющих тканях мозга выявляет тканеспецифические изменения, которые происходят параллельно с универсальными изменениями в развитии. Более того, участие генов циркадных ритмов в старении перекликается с недавними наблюдениями на мышах ⁴.

Участие множества генов, связанных с функцией митохондрий, подтверждает давно обсуждаемую важность этой органеллы в процессе старения. Также важно отметить, что многие из идентифицированных генов вовлечены в множество возрастных патологий и состояний, повышая вероятность их активного участия в процессе старения, а не пассивной ассоциации с ним.

В будущем выяснению того, как развитие механистически связано со старением, помогут универсальные часы млекопитающих. Анализ перекрестной проверки с исключением одного вида показывает, что эти часы очень хорошо обобщаются на виды млекопитающих, которые не были частью обучающего набора. Способность конструировать универсальные эпигенетические часы млекопитающих, которые могут точно предсказать возраст животных и тканей, не входивших в обучающий набор, соответствует критерию Поппера о фальсифицируемости, требующего, чтобы теория делала проверяемые прогнозы, на основе которых ее можно было бы опровергнуть. Представленные здесь эпигенетические часы, основанные на универсальности старения млекопитающих, проходят этот тест с удивительной легкостью и точностью.

МЕТОДЫ

Образцы тканей

Образцы тканей описаны в Приложении и связанных ссылках, как указано в Дополнительной информации, Примечание 1).

Контроль качества универсальных часов

Мы создали две переменные, управляюшие контролем качества (КК) исследуемых образцов; первая - это переменная, указывающая на достоверность (от 0 до 100%) оценки хронологического возраста выборки. Например, низкая достоверность была присвоена образцам от диких животных, возраст которых был оценен на основе измерений длины тела. Эпигенетические часы были обучены и оценены на образцах тканей, достоверность которых превышала 90% (> = 90%). Вторая переменная контроля качества представляла собой индикаторную переменную (да / нет), которая помечала технические отклонения или злокачественные (раковые) ткани. Поскольку нас интересовали «нормальные» паттерны старения, мы исключили ткани из доклинических исследований антиэйджинговых и проэйджинговых вмешательств.

Характеристики видов

Характеристики видов, такие как максимальная продолжительность жизни (максимальный наблюдаемый возраст), возраст половой зрелости и продолжительность беременности, были получены из обновленной версии базы данных 12 по старению и долголетию животных (AnAge, http://genomics.senescence.info/help.html#anage). Чтобы облегчить воспроизводимость, мы разместили эту измененную / обновленную версию AnAge в дополнительных данных.

Мета-анализ изучения эпигенетической зависимости (EWAS) возраста

Каждый CpG подвергался регрессии по хронологическому возрасту в каждом слое, образованном видами / тканями. Мы ограничили анализ слоями, содержащими не менее 15 наблюдений. В результате этого корреляционного теста была получена статистика t-критерия Стьюдента (обозначенная как статистика Z). Мы вычислили две разные статистики мета-анализа. Первый подход (метод Стоуффера) объединил значения P (и соответствующую статистику Z) для разных видов / слоев ткани с использованием программного обеспечения Metal 13 (методы). Мета-анализ Стоуффера привлекателен, поскольку он позволил нам вычислить значения p мета-анализа для каждого CpG. Второй подход метаанализа просто рассчитывал медианную статистику Z по стратам. Мы обнаружили, что этот подход привлекателен для предварительной фильтрации CpG в обучающих наборах универсальных часов. Мы подчеркиваем, что этот подход предварительной фильтрации не включал никаких тестовых данных. В каждом обучающем наборе мы предварительно отфильтровали верхние 4000 CpG перед моделированием часов. Для часов 1 и 2 мы использовали медианную статистику Z; для часов 3 мы использовали функцию R «rankPvalue» из пакета R WGCNA, примененную к возрастным корреляциям; для часов 4 мы использовали примерно 14 500 CpG, сопоставленных с геномами опоссума и тасманского дьявола.

Мета-анализ для EWAS возраста

Мы применили два метода для объединения результатов EWAS по видам и тканям, как описано ниже.

Двухэтапный мета-анализ в сочетании с методом Стоуфера

Наш мета-анализ комбинированной статистики корреляционного теста по возрасту рассчитан для 133 различных слоев тканей вида (от 58 видов) с минимальным размером выборки 15 (N≥15, дополнительная таблица 1.4). На первом этапе мы объединили результаты EWAS по тканям одного и того же вида, чтобы сформировать видоспецифичные результаты мета-EWAS. На втором этапе мы объединили все результаты EWAS для 58 видов, чтобы сформировать окончательный мета-EWAS возраста. Все метаанализы на обоих этапах были выполнены невзвешенным методом Стоуфера, как это было сделано в METAL¹³.

Стратификация возрастных групп

Чтобы оценить, связаны ли возраст-зависимые CpG у молодых животных с таковыми у старых животных, мы разделили данные на 3 возрастные группы: молодой возраст (возраст <1,5 * возраст половой зрелости, ASM), средний возраст (возраст от 1,5 до 3,5 ASM. ) и пожилой возрастной группы (возраст ≥ 3,5 ASM). Порог размера выборки для видов-тканей был снижен до N≥10. Возрастные корреляции в каждой возрастной группе были проанализированы с использованием вышеупомянутого двухэтапного метаанализа.

EWAS Мозга

Аналогичным образом мы применили два подхода к результатам исследования EWAS мозга; более 900 тканей головного мозга человека, верветок, мышей, оливкового бамбука, коричневых крыс и свиней в мозжечке, коре, гиппокампе, гипоталамусе, полосатом теле, субвентрикулярной зоне (SVZ) и в целом головном мозге.

EWAS одиночной ткани

Одноэтапный невзвешенный метод Стоуфера и средний балл Z также применялись к результатам EWAS для мозжечка и коры головного мозга соответственно. Аналогичным образом мы провели мета-анализ EWAS крови, печени, мышц и кожи. Результаты EWAS крови были объединены по 7 семьям, включая 367 тканей от людей, 565 от собак, 170 от мышей, 36 от косаток, 137 от дельфинов-афалин, 83 от азиатских слонов и т.д. гренландских китов, 638 тканей от 19 видов летучих мышей, 180 от косаток, 105 от голых землекопов, 72 от людей и т. д. Результаты EWAS по печени были объединены по четырем семьям, включая 583 мышей, 97 от людей, 48 от лошадей и т. д. Результаты EWAS были объединены по четырем семьям, включая 24 от вечерних летучих мышей, 57 от людей и 19 от голых землекопов и т. Д. Результаты EWAS для мозжечка были объединены по приматам и родентиям, в том числе 46 от людей. Еще 46 тканей коры головного мозга, профилированные у тех же людей, были включены в EWAS коры головного мозга, в котором метаанализ также был объединен по приматам, грызунам и третьему отряду: 16 свиней из парнокопытных. Подробная информация о стратах различных видов и тканей представлена в дополнительной таблице 2.

Мы использовали функцию R gmirror, чтобы изобразить Манхэттенские графики в зеркальном отображении.

GREAT анализ

Мы применили программный инструмент GREAT analysis⁶ к 1000 наиболее гиперметилированным и 1000 наиболее гипометилированным CpG из EWAS возраста. GREAT реализовал гипергеометрические тесты переднего плана / фона для областей генома, где мы вводим все 37k CpG-областей нашего массива млекопитающих в качестве фона и геномные области 1000 CpG в качестве переднего плана. Это дало гипергеометрические значения p, не зависящие от количества CpG в гене. Мы выполнили обогащение на основе настроек (сборка: Hg19, Proximal: 5,0 kb вверх по течению, 1,0 kb вниз по течению, плюс дистальный: до 50 kb) примерно для 76290 наборов генов, связанных с терминами GO, MSigDB (включая наборы генов для вышестоящих регуляторов) , PANTHER, путь KEGG, онтология болезней, генная онтология, фенотипы человека и мыши. Мы сообщаем наборы генов с FDR <0,05 и перечисляем номинальные гипергеометрические P-значения, P-значения с поправкой на FDR и Бонферрони.

Анализ перекрытия на основе EWAS-GWAS (Эпигенетические-генетические ассоциации)

Наш анализ перекрытия EWAS-GWAS связал наборы генов, найденные нашим EWAS возраста, с наборами генов, найденными опубликованными крупномасштабными GWAS различных фенотипов, по распределению жира в организме, результатам липидной панели, метаболическим результатам, неврологическим заболеваниям, на основе шести DNAm биомаркеров и другие возрастные признаки (дополнительная информация, примечание 3). Всего было изучено 69 результатов GWAS. Шесть биомаркеров DNAm включали четыре показателя эпигенетического ускорения возраста, полученные из 1) пан-тканевого эпигенетического возраста Хорвата, скорректированного с учетом возрастного количества клеток крови, называемого внутренним эпигенетическим ускорением возраста (IEAA) ^1,14, 2) возраста ДНК Ханнума на основе крови ¹⁵ ; 3) DNAmPhenoAge ¹⁶; и 4) средство оценки риска смертности DNAmGrimAge ¹⁷, наряду с основанными на DNAm оценками количества клеток крови и уровней ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI1) ¹⁷. Для каждого результата GWAS мы использовали программное обеспечение MAGENTA для расчета общего P-значения GWAS для каждого гена, которое основано на наиболее значимом P-значении ассоциации SNP в пределах границы гена (+/- 50 kb) с поправкой на размер гена, количество SNP на тысячу килограммов и другие потенциальные факторы, влияющие на результат ¹⁸. Мы удалили геномные области генов GWAS, присутствующих в массиве млекопитающих. Для каждого результата EWAS мы исследовали геномные области из 1000 лучших CpG, гиперметилированных и гипометилированных с возрастом, соответственно. Чтобы оценить совпадение с тестовым признаком, мы выбрали верхние 5% генов для каждого признака GWAS и рассчитали односторонние гипергеометрические значения P на основе геномных регионов (как подробно описано в 19,20). Количество фоновых геномных областей в гипергеометрическом тесте было основано на перекрытии между целыми генами в GWAS и целыми геномными областями в нашем массиве млекопитающих. Мы выделили признак GWAS, когда его гипергеометрическое значение P достигало 5 × 10в-4 с EWAS возраста в любом типе ткани.

Связь экспрессии гена LHFPL с хронологическим возрастом у человека и мыши

Чтобы изучить, играют ли LHFPL4 или LHFPL3 роль в возрастных транскрипционных изменениях, окружающих близлежащие гены, мы проанализировали несколько транскриптомных данных для разных тканей и видов. У людей в нашем анализе использовались исследования экспрессии генов из 1) проекта GTEx, 2) данных по экспрессии двух генов, изученных в ¹⁹ (наборы данных GEO из исследований 21,22) и 3) сводных данных трех исследований, проведенных Isildak et al³. для изучения возрастной экспрессии мозга в периоды развития (возраст ≥20) и старения (возраст> 20). На мышах мы проанализировали сводные данные консорциума Tabula Muris Consortium ⁴, которые сгенерировали данные секвенирования одноклеточной РНК из 23 тканей мыши на протяжении всей жизни.

Три вида универсальных часов млекопитающих для плацентарных

Мы применили модели эластичной чистой регрессии для создания трех универсальных часов млекопитающих для оценки хронологического возраста по всем тканям у здоровых людей. Три модели эластичной чистой регрессии соответствовали различным показателям результатов, описанным ниже: 1) преобразованный в журнал хронологический возраст: журнал (Возраст + 2), где было добавлено смещение в 2 года, чтобы избежать отрицательных чисел в случае пренатальных образцов, 2) - log (−log (RelativeAge)) и 3) возраст с лог-линейным преобразованием. Оценки возраста ДНК для каждых часов были вычислены с помощью соответствующего обратного преобразования. Преобразования возраста, использованные для построения универсальных часов 2–4, включали три характеристики вида: время беременности (GT), возраст половой зрелости (ASM) и максимальную продолжительность жизни (maxAge). Все эти видовые переменные измеряются в годах. Подробная информация по каждому виду представлена в дополнительных данных.

Преобразование Loglog относительного возраста для часов 2

Наша мера относительного возраста использует время беременности (GestationT) и максимальную продолжительность жизни. Мы определяем относительный возраст (RelativeAge) и применяем следующее Loglog преобразование:

По определению, RelativeAge находится в диапазоне от 0 до 1, а LoglogAge положительно коррелирует с возрастом. Универсальные часы 2 предсказывают LoglogAge, а затем применяют обратное преобразование для оценки DNAmAge:

Все характеристики видов (например, MaxAge, срок беременности) взяты из нашей обновленной версии AnAge. Мы были обеспокоены тем, что неодинаковые данные о максимальном возрасте различных видов могут исказить наш анализ. В то время как миллиарды людей были исследованы на предмет оценки максимального возраста людей (122,5 года), этого нельзя сказать ни о каком другом виде. Чтобы решить эту проблему, мы предположили следующее: истинный максимальный возраст остальных видов на 30% выше, чем указано в AnAge. Поэтому мы умножили заявленную максимальную продолжительность жизни не относящихся к человеку видов на 1,3. Наши прогностические модели оказались очень надежными в отношении этого предположения (данные не показаны).

Преобразование на основе лог-линейного возраста для часов 3

Наш показатель логарифмически-линейного возраста основан на возрасте половой зрелости (ASM). Преобразование имеет следующие свойства: принимает логарифмическую форму, если возраст меньше ASM; принимает линейную форму, когда возраст больше ASM; непрерывно дифференцируемо в точке ASM.

Во-первых, мы определяем отношение возраста к ASM следующим образом:

где смещение на 1,5 года гарантирует, что RelativeAdultAge будет положительным. Чтобы учесть более быстрый рост в молодом возрасте, мы применяем лог-линейное преобразование к RelativeAdultAge, используя функцию f (x), которая была первоначально предложена для пантканевых часов человека 1:

Это преобразование обеспечивает непрерывность и плавность в точке изменения x = 1. В нашем исследовании аргумент x - это отношение RelativeAdultAge. Следовательно, мы считаем образец в молодом возрасте, если его отношение RelativeAdultAge меньше 1. Наш логлинейный возраст (LoglinearAge) в часах 3 выражен ниже:

Аналогично, часы 3 предсказывают LoglinarAge и применяют обратное преобразование для оценки DNAmAge, как показано ниже.

Часы для сумчатых

Для сумчатых мы использовали 162 образца 7 видов. Мы применили эластичную чистую регрессию к показателю результата LoglogAge = - log (- log (RelativeAge)), как описано в формулах (1) и (2). Для оценки точности часов мы использовали только перекрестную проверку LOFO (с 5 фракциями), так как большинство выборок было получено от опоссумов (N = 100) и тасманских дьяволов (N = 41, дополнительная таблица 1.1).

Мы использовали другой конвейер для нормализации данных метилирования для сумчатых, потому что многие CpG других млекопитающих не имели аналогов в геноме сумчатых. Часы для сумчатых были обучены на основе примерно 14500 цитозинов, которые были сопоставлены как с тасманским дьяволом, так и с опоссумами.

Эластичная чистая регрессия

Мы применили модели эластичной чистой регрессии для всех наборов, в которые отбирались от 1000 до 2000 CpG для часов 1-3 и 30 CpG для сумчатых часов. Чтобы оценить точность моделей эластичной чистой регрессии, мы использовали перекрестную проверку с исключением одной фракции (LOFO) и исключения одного вида (LOSO). В LOFO мы случайным образом разбили весь набор данных на 10 фракций, каждая из которых имела одинаковое распределение по видам и типам тканей. Каждая модель регрессии со штрафами была обучена в 9 фракциях, но оценивалась в 10в-й исключенной фракции. Обойдя 10 фракций, мы пришли к прогнозам LOFO, которые впоследствии были связаны с фактическими значениями.

Подход перекрестной проверки LOSO обучил каждую модель на всех, кроме одного вида. Оставленные виды использовались в качестве тестового набора. Подход LOSO использовался для оценки того, насколько хорошо модели регрессии со штрафами распространяются на виды, которые не были частью обучающих данных. Чтобы обеспечить объективные оценки точности, все аспекты подгонки модели (включая предварительную фильтрацию CpG) проводились только в обучающих данных как в анализе LOFO, так и в анализе LOSO. Упругая регрессия сети в данных обучения была реализована путем установки параметра модели glmnet alpha на 0,5. Десятикратная перекрестная проверка данных обучения использовалась для оценки лямбда параметра настройки. По вычислительным причинам мы подобрали модель glmnet для 4000 лучших CpG с наиболее значимым медианным Z-баллом (тест корреляции возраста) в обучающих данных. Чтобы учесть различные размеры выборок видов, мы использовали взвешенную регрессию по мере необходимости, где вес был обратным квадратному корню из частоты видов или 1/20 (в зависимости от того, что было больше). В окончательных версиях различных универсальных часов использовались все доступные данные.

Статистика оценки прогностических возможностей модели

Для проверки нашей модели мы использовали оценки возраста ДНК из анализа LOFO и LOSO, соответственно. Для каждого типа оценок мы выполнили коэффициенты корреляции Пирсона и вычислили медианную абсолютную разницу (MAE) между переменными, основанными на DNAm, и наблюдаемыми для всех образцов. Корреляция и MAE также вычислялись на уровне видов, ограничиваясь подгруппой с выборками N> = 15 (внутри вида или внутри категории вид-ткань). Мы указали медианы для оценок корреляции (med.Cor) и медианы для оценок MAE (med.MAE) по видам соответственно. Аналогичным образом мы повторили тот же анализ на уровне вид-ткань, ограничившись подгруппой с образцом N> = 15 (в категории вид-ткань).

URLs

AnAge, http://genomics.senescence.info/help.html#anage

UCSC genome browser: http://genome.ucsc.edu/index.html

Доступность данных

Данные будут опубликованы на сайте Gene Expression Omnibus.

Вклад авторов

Аке Т. Лу, Чжэ Фэй, Цезарь Ли, Джозеф Золлер, Ш. разработали универсальные часы. ATL, Amin Haghani, Charles Breeze, Michael Thompson, Matteo Pellegrini, Wanding Zhou, SH провели дополнительный биоинформатический анализ. Адриана Арнесон, Джейсон Эрнст, SH разработали массив метилирования млекопитающих. ATL, Ken Raj, SH подготовили первую версию статьи. Остальные авторы предоставили ценные ткани или образцы ДНК или помогли в процессе создания данных. Все авторы помогли с редактированием статьи и интерпретацией данных. SH задумал исследование.

КОНКУРИРУЮЩИЕ ИНТЕРЕСЫ

SH является основателем некоммерческого фонда развития эпигенетических часов, который планирует лицензировать несколько патентов у своего работодателя UC Regents. В этих патентах в качестве изобретателей указаны SH, JE, AA. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

CORRESPONDING AUTHOR

Correspondence to Steve Horvath (shorvath{at}mednet.ucla.edu)

БЛАГОДАРНОСТИ и ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана в основном группой Paul G. Allen Frontiers Group (SH).

Опубликовано: 19 января 2021 г.

Оригинальная статья (PDF): Universal DNA methylation age across mammalian tissues

Перевод Ник Сестрин

Ограниченное омоложение старых гемопоэтических стволовых клеток в молодой нише костного мозга

ГСК

Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) с возрастом обнаруживают функциональные изменения, такие как снижение регенеративной способности и миелоидно-зависимая дифференцировка. Ниша HSC, которая важна для поддержания HSC, также претерпевает заметные изменения с возрастом. Однако было технически сложно напрямую оценить вклад старения ниши в связанные с возрастом изменения HSC без миелоабляции, повреждающей нишу, в пробах трансплантированных HSC. Здесь мы трансплантировали избыток старых HSC молодым мышам без предварительной обработки. Хотя старые HSC успешно приживаются в интактных молодых нишах костного мозга, они плохо регенерируют нижестоящие клетки-предшественники и обнаруживают стойкие изменения, обусловленные миелоидным смещением, что не приводит к значительному функциональному омоложению. Анализ транскриптома и метилома выявил, что молодая ниша в значительной степени восстанавливает профиль транскрипции старых HSC, но не их профили метилирования ДНК. Следовательно, восстановления молодой ниши недостаточно для омоложения функций HSC, что подчеркивает ключевую роль связанных с возрастом внутренних клеточных дефектов при старении HSC.

Оригинальная статья (PDF): Limited rejuvenation of aged hematopoietic stem cells in young bone marrow niche

Введение

Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) дают начало всем линиям клеток крови на протяжении всей жизни. Однако возможности HSC заметно меняются с возрастом, включая нарушение регенерации, миелоидно- и тромбоцитарно- обусловленное видоизменение, за счет выработки функциональных лимфоцитов, а также и более высокую склонность к формиелоидным злокачественным новообразованиям (Oshima and Iwama, 2014; Akunuru andGeiger, 2016; Verovskaya et al. др., 2019). Эти изменения являются следствием зависящих от времени внутренних изменений HSC и постоянного воздействия внешних стрессов; однако степень, в которой эти факторы способствуют старению HSC, еще не выяснена (de Haan, Lazare, 2018; Verovskaya et al., 2019). Считается, что старые HSC несут присущие клетке молекулярные изменения, которые не могут быть восстановлены молодой нишей, как предполагало предыдущее исследование, показавшее, что старые HSC, трансплантированные в смертельно облученных молодых мышей-реципиентов, демонстрировали функциональные нарушения по сравнению с молодыми HSC, трансплантированными молодым реципиентам (Dykstra и др., 2011).

Напротив, молодые HSC, трансплантированные смертельно облученным пожилым реципиентам, прививаются хуже, чем при трансплантации молодым реципиентам, что указывает на то, что возрастные внешние клеточные изменения влияют на функцию HSC (Rossi et al., 2005; de Haan and Lazare, 2018). находки подчеркивают критическую роль внутренних и внешних факторов в процессе старения HSC. Тем не менее, предварительное кондиционирование на основе облучения значительно изменяет структуру и функции микросреды костного мозга (КМ) (Hooper et al., 2009; Tikhonova et al., 2019), что исключает возможность точной оценки прямого вклада возрастзависимых внешних изменений на функции HSC.

Специализированные микроокружения костного мозга (BM), названные нишами HSC, поддерживают количество и функцию HSC посредством клеточных взаимодействий и секретируемых факторов (Morrison and Scadden, 2014). Пространство для HSC, которое они занимают в BM, считается ограниченным из-за небольшого количества доступных ниш. И поскольку, большинство этих ниш уже занято эндогенными HSC, требуется миелоаблативное предварительное кондиционирование, такое, как облучение и химиотерапия, чтобы освободить ниши для трансплантированных HSC (Nilsson et al. др., 1997; Шиозава и др., 2008). Однако облучение и химиотерапия повреждают интактные ниши костного мозга, как было продемонстрировано ранее (Hooper et al., 2009; Tikhonova et al., 2019). Облучение вызывает расширение сосудов, проницаемость и пролиферацию эндотелиальных клеток (Chen et al., 2019).

Мы продемонстрировали, что в эндотелиальных клетках BM после облучения и химиотерапии активировался p53, что приводило к расширению и коллапсу эндотелиальных клеток сосудов, а также снижению количества периваскулярных мезенхимальных стромальных клеток (Si et al., 2018). Хотя эти изменения являются временными, долговременные дефекты сосудистой сети костного мозга после облучения еще не выяснены. Кроме того, летальное облучение оставляет стойкие повреждения стромы костного мозга. Мультипотентные клетки-предшественники стромы костного мозга были потеряны и не смогли спонтанно восстановиться после облучения. По сравнению с необработанными контролями соответствующего возраста, их уровни оставались ниже 10% в течение как минимум 4 месяцев после облучения (Abbuehl et al., 2017). Таким образом, было технически сложно напрямую исследовать взаимосвязь между трансплантированными HSC и интактными нишами. Чтобы преодолеть это ограничение, в предыдущих исследованиях использовали моноклональные антитела Anti- c-Kit, которые истощают HSC из ниш BM, тем самым позволяя приживать донорские HSC у иммунодефицитных мышей (Chechowiczet al., 2007). Повышение Fc-опосредованной эффекторной активности антител за счет блокады CD47, миелоид-специфического иммунного маркера, далее позволило распространить кондиционирование Anti-c-Kit на полностью иммунокомпетентных мышей (Chhabra et al., 2016) Напротив, Shimoto et al. (2017) недавно сообщили, что при трансплантации большого количества HSC мышам-реципиентам без миелоабляции донорские HSC внедрялись в ниши, которые не были заняты HSC-хозяевами, и впоследствии регенерировали BM, что согласуется с предыдущими данными (Bhattacharya et al., 2006; Westerhuiset al. ., 2011). Таким образом, многочисленные пустые ниши HSC, по-видимому, доступны для приживления и пролиферации донорских HSC. В настоящем исследовании мы трансплантировали избыток старых HSC молодым реципиентным мышам без предварительного кондиционирования и оценивали влияние неповрежденной молодой ниши на функции, транскриптом. и эпигеном старых HSC.

Полученные результаты

Характеристики старых HSC, привитых в неповрежденную молодую нишу

Первоначально мы оценивали гематопоэз у мышей в возрасте 8–10 недель (молодые), 12 месяцев (средний возраст) и 20–21 месяцев (пожилые) мышей и подтвердили, что частота миелоидных клеток (Mac-1 + и / или Gr1 +) значительно увеличивается в периферической крови (PB), в то время как количество T-клеток (CD4 + или CD8 +) и B-клеток (B220 +) с возрастом уменьшается (рис. 1 A). . Затем мы исследовали следующие компоненты гематопоэтических стволовых клеток и предшественников (HSPC) в BM: HSC (CD150 + CD48-CD135-CD34-линия-Sca-1 + c-Kit + [LSK]), мультипотентные предшественники 1 (MPP1; CD150+ CD48- CD135- CD34+ LSK), MPP2 (CD150+ CD48+ CD135- CD34+ LSK), MPP3 (CD150- CD48+ CD135- CD34+ LSK) и MPP4 (CD150- CD48+ CD135+ CD34+ LSK; Cabezas-Wallscheid et al., 2014). Как сообщалось ранее (Sudo et al., 2000; Geiger et al., 2013; Young et al., 2016; Elias et al., 2017), как абсолютное количество, так и частота HSC значительно увеличиваются с возрастом, тогда как для MPP4, предрасположенных к лимфоидной дифференцировке, они значительно снижаются (Fig. 1 B). Чтобы оценить влияние ниши стареющего костного мозга на фенотипические изменения в HSC при старении, мы попытались переключиться со стареющей ниши на неповрежденную молодую нишу путем трансплантации избытка стареющих HSC молодым реципиентным мышам без какого-либо предварительного кондиционирования с использованием ранее описанного метода (Shimoto et al. ., 2017).

Первоначально мы очищали 1 × 10в4 HSC, LSK и c-Kit + клетки, которые содержали 1 × 10в4 HSC от 10-недельных мышей, и трансплантировали их 8-недельным мышам без облучения (рис. 1C). Через два месяца после трансплантации мы оценили приживление донорских клеток в периферической крови (PB) и костном мозге (BM). Клетки c-Kit + установили самый высокий химеризм в PB, за которым следуют клетки LSK. Напротив, HSC были неэффективны в репопуляции гемопоэза у некондиционных мышей-реципиентов (рис. 1, D и E). Эти результаты ясно продемонстрировали, что эффективность приживления и повторного заселения значительно различается в зависимости от фракций HSPC при трансплантации без предварительного кондиционирования. Присутствие гематопоэтических клеток-предшественников может способствовать приживлению HSC, а включение различных антител для очистки может препятствовать приживлению HSC. Основываясь на этих результатах, мы впоследствии выполнили следующие трансплантации без предварительного кондиционирования с использованием клеток Aged LSK или c-Kit+.

Мы очистили клетки LSK от 10-недельных и 20-месячных мышей и трансплантировали их в дозах, соответствующих 1-2 × 10в4 и 1,8-8,6 × 10в4 HSC (CD150+ CD48- CD135- CD34- LSK) соответственно. в молодых мышей-реципиентов без миелоабляции. Затем повторно заселяли донорские молодые (Young ) и старые (Aged) HSC молодым мышам-реципиентамов (Y) в течение 2 мес. (Далее называемые Young / Y и Aged / Y, соответственно; рис. 1 F). В соответствии с предыдущими результатами, мы наблюдали успешное приживление донорских HSC у молодых мышей-реципиентов через 2 месяца после трансплантации (рис. 1, G – K). В костном мозге HSC Aged / Y показали более высокий химеризм в компартменте (в отдельной фракции) HSC, чем в находящихся ниже по течению компартментах LSK и lineage-c-Kit + (LK), в отличие от HSC Young / Y, для которых химеризм был выше в компартментах LK (рис. 1 H). Полученные от донора HSPC были относительно сбалансированы компартментами HSC и MPP1 соответственно MPP4 у реципиентов HSC Young / Y, что указывает на то, что трансплантация без предварительного кондиционирования не влияет на способность дифференцировки HSC (Рис. 1 I).

Напротив, у Aged / Y HSC реципиентов среди полученных от донора HSPC преобладали в основном незрелые HSC, что указывает на то, что старые HSC плохо дифференцируются в стадию MPP (Fig. 1 I). Соответственно, HSC Young / Y установили более высокий химеризм в PB, чем Aged HSC (рис. 1 J). По сравнению с HSC реципиента, HSC Aged / Y преимущественно демонстрировали заметно миелоидную дифференцировку в PB, тогда как Young / Y HSCs обнаруживали лимфоидно-доминантную репопуляцию (Fig. 1 K). Эти результаты показали, что длительные процессы старения нарушают способность дифференцировки HSC в мультипотентные предшественники (MPP), что может лежать в основе накопления HSC у пожилых мышей. Более того, возрастные дефекты дифференцировки в HSC, по-видимому, не восстанавливаются даже после переноса в молодую нишу BM.

Чтобы изучить способность к репопуляции Aged / Y HSCs более подробно, мы выполнили вторичную трансплантацию BM (рис. 2A). Мы собрали полученные от донора Aged / Y и полученные от реципиента клетки-хозяева Young LSK, содержащие 100 HSC, от первичных мышей-реципиентов и трансплантировали их смертельно облученным вторичным реципиентам с 2 × 10в5 конкурирующими клетками ВМ. Мы также трансплантировали клетки Aged LSK, содержащие 100 HSC, в качестве контроля. Способность к повторному заселению клеток Aged / Y была значительно ниже, чем у HSC Young хозяина. Вклад Aged / Y HSC в PB-клетки не был больше, чем вклад Aged HSC (рис. 2, B и C), что указывает на то, что старые HSC не были функционально омоложены молодой нишей у первичных реципиентов. Анализ BM также выявил, что дефектная дифференцировка Aged HSC в MPP, наблюдаемая у первичных молодых реципиентов, сохраняется после вторичной трансплантации (Fig. 2 D). Мы повторили вторичную трансплантацию костного мозга после трансплантации костного мозга без предварительной обработки с использованием 100 молодых, Aged/Y, и Aged HSC на реципиента. И получили те же результаты (данные не показаны). Напротив, 12-месячные HSC, которые прижились в молодой нише (Middle / Y HSC), показали профили дифференцировки HSPC между Young / Y и Aged / Y HSC в BM (рис.2, E и F) и умеренную репопуляцию, обусловленную миелоидным смещением в PB (Fig. 2 G). Middle / Y HSCs показали умеренное восстановление способности к репопуляции, но не смещенной дифференцировки, у вторичных реципиентов по сравнению с контрольными средними HSC (Fig. 2, HJ). Эти результаты демонстрируют, что интактная молодая ниша BM имеет тенденцию частично восстанавливать способность к репопуляции средних, но не старых HSC.

Рисунок 1. Гематопоэз с помощью старых HSC, привитых в некондиционированную молодую нишу. (A) Частоты миелоидных (Mac-1 + и / или Gr-1 +), B (B220 +) и T (CD4 + или CD8 +) клеток в PB молодых, средних и пожилых мышей. (B) Число клеток (слева) и частоты (справа) BM HSPCs. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (n = 5-7, представитель двух независимых экспериментов). (C) Экспериментальная стратегия для оценки эффективности приживления фракций HSPC в молодой нише. Очищенные 1 × 10в4 HSC и клетки LSK и c-Kit +, которые содержали 1 × 10в4 HSC от 10-недельных мышей, трансплантировали 8-недельным мышам без облучения. (D) Химеризм донорских гемопоэтических клеток в CD45 + (CD45.1 + CD45.2) гемопоэтические клетки, миелоидные, В- и Т-клетки в PB мышей-реципиентов (n = 6). (E) Химеризм донорских клеток в HSCs и MPP BMP мышей-реципиентов через 2 мес после трансплантации (n = 6, объединены из трех независимых экспериментов). (F) Экспериментальная стратегия для функциональной оценки старых HSCs в молодой нише. Различное количество клеток LSK, содержащих 1-2 × 10в4 HSC от молодых мышей (молодые HSC) или клеток LSK, содержащих 1,8-8,6 × 10в4 HSC из старых HSC, трансплантировали 8-недельным мышам без облучения. Мы использовали объединенные донорские HSC, собранные от нескольких мышей. (G) Стратегии гейтинга для идентификации молодых и пожилых / Y HSC и MPP1-4. Указаны частоты в общих клетках ВМ. (H) Химеризм донорских клеток в HSC, LSK и LK клетках КМ через 2 месяца после трансплантации. Каждая точка представляет собой среднее значение одной когорты, состоящей из от одной до четырех мышей. Оси x указывают количество HSC, которые содержались в трансплантированных клетках LSK. (I) Частоты HSC и MPP, происходящие от донора и реципиента, и MPP в клетках BM, соответственно. Данные по среднему значению для каждой когорты, состоящей из одной-четырех мышей, показаны на отдельных столбцах. (J) Химеризм донорских гемопоэтических клеток в CD45 + (CD45.1 + CD45.2) гемопоэтических, миелоидных, B и T-клетках в PB мышей-реципиентов. Каждая точка представляет собой среднее значение для одной когорты, состоящей из от одной до четырех мышей. Оси x указывают количество HSC, которые содержали интрансплантированные клетки LSK. (K) Частоты миелоидных, B- и T-клеток, полученных от донора и реципиента, в клетках PB, соответственно. Данные о среднем значении каждой когорты, состоящей из от одной до четырех мышей, показаны в отдельных столбцах. Планки погрешностей представляют SEM. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001 однофакторным дисперсионным анализом.

Одним из основных фенотипов старых HSC, который не разрешился в молодой нише, был миелоидный перекос в дифференцировке. В предыдущих исследованиях сообщалось о значительном увеличении частоты миелоидных HSC с возрастом (Muller-Sieburget al., 2004; Beerman et al., 2010; Challen et al., 2010; Dykstraet al., 2011). Старение связано с прогрессирующим увеличением количества миелоидных HSC с высоким уровнем экспрессии CD150 (Beerman et al., 2010). Старые HSC показали более высокие уровни экспрессии CD150, чем молодые HSC, что указывает на то, что большинство трансплантированных старых HSC были внутренне миелоидно- смещенными. Aged / Y HSC через 2 месяца после трансплантации имели тенденцию снижать уровни своей экспрессии, но все же сохраняли более высокие уровни, чем молодые HSC (рис. 2 K). Эти результаты предполагают, что старые HSC претерпели ограниченное омоложение с точки зрения экспрессии CD150 и сохранили миелоидно-зависимые свойства дифференцировки даже после приживления в некондиционированной молодой нише. Поскольку миелоидно-смещенные HSC также присутствовали у молодых мышей, молодая ниша, возможно, не изменила заметно выход клонов старых HSC.

Двухмесячная инкубация в молодой нише может быть недостаточной для того, чтобы старые HSC подверглись омоложению. Поэтому мы трансплантировали молодые и старые клетки c-Kit +, содержащие 1 × 10в4 HSC, мышам-реципиентам без кондиционирования и провели долгосрочные последующие исследования (рис. S1 A). Гематопоэз, полученный из молодых и старых HSPC, привитых в молодую нишу (Young / Y и Aged / YHSPC, соответственно), оценивали через 4 месяца после трансплантации. Старые / Y HSPC выявляли заметно более низкий химеризм, чем Young / Y HSPC в PB (рис. S1). Б). Ａｇｅｄ/ Y HSPC показали более выраженную миелоидно-смещенную репопуляцию, чем Young / Y HSPC, которая была более заметна через 4 мес, чем через 2 месяца после трансплантации (рис. S1, B и C). В BM, Aged / Y HSPCs плохо дифференцировались в стадию MPP даже через 4 месяца после трансплантации (Fig. S1 D). Уровни экспрессии CD150 были значительно выше в HSC Aged / Y, чем в HSC молодого хозяина (рис. S1E). Затем мы очистили 100 HSC Young / Y и Aged / Y от первичных реципиентов и трансплантировали их смертельно облученным мышам с 2 × 10в5 конкурентными клетками. Aged / Y HSC снова обнаружили миелоидную репопуляцию в PB и нарушенную дифференцировку HSC в MPP в BM (Fig.S1, F-H). Эти результаты показали, что ниша молодого костного мозга не способна функционально омолаживать старые HSC даже с более длительным периодом приживления.

Молодая ниша в значительной степени омолаживает профили транскриптомов Aged HSC. Чтобы получить более детальное понимание влияния старой ниши на транскриптомы HSC, мы выполнили анализ секвенирования РНК Aged, Young и Aged / Y HSCs (рис. 3A). Анализ главных компонентов (PC) с первыми двумя компонентами (PC1, 32,1%; PC2, 21,3%) показал, что Aged / Y HSC транскрипционно отличны от Aged HSC и близки к HSC молодых (рис. 3 B). Более того, иерархическая кластеризация показала, что Aged / Y HSCs были отнесены к тому же кластеру, что и Young HSC (Рис. 3 C), что указывает на то, что старые HSC транскрипционно репрограммировались в сторону молодых HSC.

Затем мы определили дифференциально экспрессируемые гены (DEG) между молодыми и старыми HSC, используя значение отсечения q <0,05. В целом, 629 и 957 генов подвергались повышающей и понижающей регуляции, соответственно, в Aged HSC по сравнению с таковыми в Young HSC, соответственно (Рис. 3 D и таблица S1). Эти DEG были разделены на пять кластеров (C1 – C5) с помощью кластеризации K-средних, причем DEG в C1, C3 и C5 подавлялись, а DEG в C2 и C4 активировались в старых HSC по сравнению с таковыми в молодых HSC. (Рис. 3 E). Чтобы оценить степень, в которой транскриптом в Aged / Y HSC был инвертирован молодой нишей, мы произвольно установили средние уровни экспрессии DEG в каждой группе молодых и Aged HSC на 0 (группы HSC с низким уровнем экспрессии) или 1 (HSC группы с более высокими уровнями экспрессии), а затем рассчитали средние уровни экспрессии DEG в Aged / Y HSC (Рис. 3 E). Показатели Aged / Y HSC в C1, C2 и C5 были заметно ближе к показателям молодых HSC, чем Aged HSC, что указывает на то, что DEG в этих кластерах в значительной степени подвергались нишезависимому репрограммированию в молодые HSC. Напротив, оценки Aged / Y HSCs в C3 и C4 были заметно ближе к показателям Aged HSC, указывая на то, что DEG в этих кластерах в значительной степени представляют собой устойчивые к нише, внутренние изменения HSC (рис. 3, E и F). Мы получили аналогичные результаты в другой когорте (когорта 3; рис. S2, A – C), в которой DEG, идентифицированные в когортах 1 и 2 (C1 – C5 на рис. 3 D), показали аналогичные изменения экспрессии (рис. S2 D). В совокупности эти результаты показали, что многие изменения транскриптома Aged HSC зависят от старения ниши и, таким образом, обратимы при переносе в молодую нишу.

Рисунок 2: стойкие функциональные дефекты пожилых HSC в молодой нише. (A) Экспериментальная стратегия для функциональной оценки старых HSCs в молодой нише. Старые клетки LSK, содержащие 8,6 × 10в4 HSC, трансплантировали молодым мышам-реципиентам без облучения. Донорские (Aged / Y) и хозяйские (молодые) LSK-клетки, содержащие 100 HSC, были очищены от первичных реципиентов через 2 месяца после трансплантации и затем трансплантированы смертельно облученным 8-недельным вторичным реципиентным мышам вместе с 2 × 10в5 клетками-конкурентами. Свежевыделенные Aged LSK клетки, содержащие 100 HSC, также трансплантировали в качестве контролей. (B) Химеризм донорских гемопоэтических клеток в CD45 + (CD45.1 + CD45.2) гематопоэтических, миелоидных, B и T-клетках в PB мышей-реципиентов, получавших Young, Старые или Старые / Y LSK клетки (n = 3-5). (C) Частоты миелоидных, B- и T-клеток в донорских клетках PB через 6 месяцев после трансплантации (n = 3-5). (D) Химеризм. донорских HSPCs в BM HSCs и MPP у мышей-реципиентов через 6 месяцев после трансплантации (n = 3-5, репрезентативные из трех независимых экспериментов). (E) Экспериментальная стратегия для функциональной оценки средних HSCs в молодой нише. Клетки c-Kit +, содержащие ~ 1,0–1,4 × 10в4 HSC от 12-месячных мышей, трансплантировали 8-недельным мышам без облучения. Через 2 месяца после трансплантации анализировали гемопоэтические клетки, полученные из прививаемых средних HSC (средние / Y HSC) и хост-HSC (молодые HSC) (F и G; данные были объединены из четырех независимых экспериментов). В то же время 100 HSC Middle / Y и хозяина (Young), очищенные от первичных реципиентов, были трансплантированы смертельно облученным 8-недельным вторичным реципиентным мышам вместе с 2 × 10в5 BM клетками-конкурентами. Свежевыделенные HSC от 12-месячных мышей. (Средние HSC) также трансплантировали в качестве контроля (H – J; показаны репрезентативные данные из двух независимых экспериментов). (F) Химеризм клеток, происходящих из средних HSC, в BM HSC, LSK-клетках и LK-клетках через 2 месяца после трансплантации (n = 4). Оси x указывают количество HSC, которые содержались в трансплантированных клетках c-Kit + (левая панель). Показаны частоты происходящих из средних HSC и получателя HSC и MPP в фракции HSC / MPP (правая панель). Данные для каждой мыши-реципиента показаны в отдельных столбцах. (G) Химеризм гемопоэтических клеток, полученных из средних HSC, в гематопоэтических клетках CD45 + (CD45.1 + CD45.2), миелоидных, B- и Т-клеток в PB мышей-реципиентов (n = 4). По оси x указано количество HSC, которые содержали трансплантированные клетки c-Kit + (левая панель). Частоты донорских (средние HSC) и полученных от реципиента миелоидных, B- и T-клеток в PB (правая панель). Данные для каждой мыши-реципиента показаны в отдельных столбцах. (H) Химеризм донорских гематопоэтических клеток в CD45 + (CD45.1 + CD45.2) гематопоэтических, миелоидных, B и T-клетках в PB мышей-реципиентов, получавших Young, Middle / Y- и средние HSC (n = 5). (I) Частоты миелоидных, B- и T-клеток в клетках, полученных от донора, через 6 месяцев после трансплантации в H (n = 5). (J) Химеризм клеток, полученных от донора в HSC и MPP в BM у мышей-реципиентов через 6 месяцев после трансплантации в H (n = 5). (K) Экспрессия CD150 в HSC Aged / Y у мышей-реципиентов через 2 месяца после трансплантации в D. Репрезентативные гистограммы, показывающие экспрессию CD150 в HSC (левая панель) и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD150, показанная как среднее ± стандартная ошибка среднего (n = 5). *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001 однофакторным дисперсионным анализом. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001; ns, не имеет значения при одностороннем дисперсионном анализе.

Анализ обогащения набора генов (GSEA) подтвердил, что Aged / Y HSC подвергались транскрипционному репрограммированию в сторону частичного ослабления сигнатуры старения (Wahlestedt et al., 2013; Fig. 4A and Table S2 A). Анализ онтологии генов (GO) выявил, что обратимые DEG в C1, C2 и C5 были связаны с клеточными метаболическими процессами (рис. 4B и таблица S2 B), предполагая главную роль ниши BM в регуляции метаболизма HSC. Связь между необратимыми DEG (C3 и C4) и конкретными путями / процессами не была ясна из-за их небольшого количества (рис. 4 B и таблица S2 B).

Возрастное аберрантное метилирование ДНК устойчиво к омоложению ниши

Различные эпигенетические изменения, включая метилирование ДНК, были признаны одним из признаков старения (López-Ot ́ınet al., 2013). Эпигенетические маркеры могут легко меняться со временем, и этот «эпигенетический дрейф», который зависит как от внутренних, так и от внешних факторов, может играть важную роль в старении HSC (Issa, 2014). Чтобы оценить изменения в метилировании ДНК, мы выполнили полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS) на Young, Aged,и Aged/Y HSC (Таблица S3 A). В целом, низкие уровни метилирования ДНК были обнаружены на CpG-островках (CGI), которые включали промоторные CGI, тогда как высокие уровни метилирования ДНК наблюдались в энхансерных областях (Рис. 5 A). Не было отмечено значительных изменений в уровнях метилирования ДНК среди Young, Aged,и Aged/Y HSC в CGI или энхансерных областях; тем не менее, старые HSC показали умеренное увеличение (рис. 5 A). Иерархическая кластеризация не выявила значительного восстановления глобального метилирования ДНК в Aged / Y HSC, но скорее показала умеренное прогрессирование аберрантного метилирования ДНК в Aged / Y HSC во время повторного заселения в молодой нише BM (Рис. 5 B). Мы определили дифференциально метилированные области (DMR) среди Young, Aged и Aged/Y HSC как те, которые показывают значения отсечения q <0,05. Мы идентифицировали 3 463 и 1 125 DMR во время старения (Aged vs. Young), 3699 и 1145 DMR после приживления в молодой нише (Aged / Y по сравнению с Young) и 1925 и 848 DMR (Aged / Y по сравнению с Aged) в CGI и энхансерах, соответственно. (Рис. S3 A). Мы определили гипер- и гипо-DMR как те, которые демонстрируют разницу в метилировании ≥5,0% (рис. S3 A и таблица S3 B). HSC приобрели больше гипер-, чем гипо-DMR (619 против 120) на CGI с возрастом (Aged vs. Young), но показали очень легкий сдвиг от гипер- к гипо-DMR (606 против 179) после приживления в молодой нише (Aged / Y против Янга). Напротив, HSC приобретают больше гипо-DMRs на энхансерах, чем CGIs, с возрастом и после приживления в молодой нише (Рис. 5 C). Следовательно, различия в метилировании ДНК в DMR были немного ниже в Aged / Y HSC, чем в Aged HSC, причем редукции были больше у энхансеров, чем у CGI (рис. 5 D). Более того, гипер-DMR в Aged HSC и Aged / Y HSC значительно перекрывались в CGI, тогда как в энхансерных областях были более вариабельны (Рис. 5 E). В соответствии с предыдущими выводами (Beerman et al., 2013) связь между уровнями экспрессии генов и уровнями метилирования ДНК в HSC не кажется сильной. Гены Hyper-DMR в Aged HSC не показали значительных изменений в экспрессии (рис. 5 F), и гены гипер-DMR, которые перестали быть гипер-DMR в Aged / Y HSC, не были связаны с активацией транскрипции (рис. S3 B). Мы подтвердили эти результаты в другой когорте, используя анализ WGBS (рис. S3, C – H). В совокупности эти результаты указывают на то, что связанные с возрастом изменения в метилировании ДНК были более стабильными, чем в транскриптоме, и устойчивы к омоложению ниши. Более того, омоложение ниши преимущественно индуцировало деметилирование ДНК в энхансерных областях; однако это, по-видимому, не объясняет омоложение транскрипции.

Таким образом, мы продемонстрировали, что транскриптом старых HSC, но не профиль метилирования ДНК или их функции, могут в значительной степени восстанавливаться до таковых у молодых HSC после приживления в неповрежденной молодой нише.

Рисунок 3. Молодая ниша в значительной степени омолаживает профиль транскриптома старых HSC. (А) Экспериментальная стратегия. 3000 донорских HSC Aged / Y и Young HSC хозяина, очищенных от первичных реципиентов через 2 месяца после трансплантации Aged HSC без облучения, вместе с 3000 HSC от 20-месячных мышей подвергали анализу РНК-секвенирования. (B) PC анализ на основе ряда значений Z величины экспрессии (нормализованное количество DESeq2) в Young, Aged, и Aged/Y HSC (n = 2 для каждого, объединенные из двух независимых экспериментов). (C) Иерархическая кластеризация на основе коэффициента корреляции Пирсона DESeq2 нормализованных значений в Young, Aged, и Aged/Y HSC (n = 2). (D) График MA, показывающий log10 нормализованных значений и log2 кратных изменений в старых и молодых HSC Красные и синие точки представляют 629 активированных (UP) и 957 отрицательных (DOWN) DEG во время старения. Пороговое значение q <0,05 использовалось для определения DEG. (E) К-средние кластеризации DEG, определенные в D. Тепловая карта представляет собой Z-величины нормализованных значений в Young, Aged, и Aged/Y HSC. Указаны номера кластеров (C1 – C5) и средние показатели экспрессии генов для каждой группы HSC. (F) Обратимые и необратимые изменения средней экспрессии генов в Aged / Y HSC. Средние оценки экспрессии DEG в молодых или старых HSC были масштабированы от 0 до 1, а оценки DEG в Aged / Y HSC были нормализованы.

Предыдущие исследования сообщали об изменениях в нише костного мозга с возрастом (Pinho and Frenette, 2019) и предполагали, что воздействие дифференциальных сигналов из стареющей ниши играет роль в функциональных изменениях HSC. Экспрессия генов, связанных с метаболическими процессами, нарушение регуляции которых является одним из отличительных признаков старения HSC (Chandel et al., 2016), также была обратима за счет изменения ниши, что подчеркивает ключевой вклад старения ниши в нарушение регуляции транскрипции и метаболизма в старых HSC. Тем не менее, старые HSC не были функционально омоложены в неповрежденной молодой нише, что указывает на то, что внутренние клеточные изменения в старых HSC сохраняются независимо от условий ниши. Эти чередования включают генетические и эпигенетические изменения и ухудшение митохондрий, и здесь мы наблюдали тонкие изменения в статусе метилирования ДНК в старых HSC после замены ниши. Ранее было показано, что дифференцированное метилирование ДНК HSC, связанное с возрастом, в значительной степени зависит от пролиферативной истории HSC. Физиологическое старение и экспериментально усиленная пролиферация HSCs приводят к гиперметилированию ДНК генов, регулируемых репрессивным комплексом Polycomb 2 (Beerman et al., 2013; Sun et al., 2014). Следовательно, принудительное повторное заселение старых HSC в молодую нишу, даже если молодая ниша свободна от повреждений, вызванных миелоабляционным воздействием, возможно, способствовало распространению изменений в ландшафте метилирования ДНК в Aged HSC. Yu et al. (2016) исследовали функциональные, транскрипционные и эпигенетические (метилирование ДНК и доступность хроматина) атрибуты HSC на аклональном уровне с использованием эндогенного флуоресцентного мечения и обнаружили, что внутриклональное поведение было задано эпигенетическим сценарием, но не всегда соответствовало состоянию транскрипции, что предполагает, что ответственность за клеточно-автономное поведение HSC несут различия в эпигеноме, а не в нише.

Рисунок 4: Нишезависимое частичное транскрипционное омоложение старых HSC. (A) Графики GSEA с наборами генов, которые активируются (UP) или подавляются (DOWN) в Aged HSC (Wahlestedt et al., 2013). Указаны нормализованная оценка обогащения (NES), номинальное значение P (NOM) и частота ложных обнаружений (FDR). (B) GO-анализы биологических процессов и другие анализы указанных путей с использованием DEG в каждом кластере. Пороговое значение P <0,05 используется для обозначения значительного обогащения.

В совокупности эти находки и настоящие результаты предполагают, что эпигеном является более подходящей метрикой для функций HSC, чем транскриптом. Мы предполагаем, что клоны HSC со специфическими эпигенетическими конфигурациями отбираются во время старения, что приводит к функциональным изменениям HSC в целом. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизмов, которые необратимо влияют на функцию HSC во время старения.

Рисунок 5. Связанное с возрастом аберрантное метилирование ДНК устойчиво к омоложению ниши. (A) Скрипичные диаграммы, показывающие глобальные уровни метилирования ДНК в Young,Aged, и Aged/Y HSC на CGI и энхансерах. Средние и медианные значения обозначены красными точками и горизонтальными полосами, соответственно. (B) Данные иерархической кластеризации, основанные на коэффициенте корреляции Пирсона метилирования ДНК в CGI и энхансерах в Young,Aged, и Aged/Y. HSC (C) Процентные доли гипер- и гипо-DMR в CGI и энхансерах в Aged и Aged / Y HSC по сравнению с указанными HSC. Среди DMR со значительными различиями в уровнях метилирования от таковых в контрольных HSC (q <0,05) те, которые демонстрируют разницу в метилировании ≥5,0%, были определены как гипер- и гипо-DMR. (D) Скрипичные диаграммы, показывающие разницу в метилировании ДНК (процент) в DMR между тестом (Aged или Aged / Y HSC) и контролем (молодые HSC). Средние и медианные значения обозначены как красные точки и горизонтальные полосы, соответственно. (E) Диаграммы Венна, показывающие перекрытие гипер- и гипо-DMR на CGI и энхансерах между Aged и Aged / YHSC. Гипер- и гипо-DMR были определены в Aged и Aged / Y HSC с использованием молодых HSC в качестве контроля. (F) Скрипичные диаграммы, показывающие изменения экспрессии всех генов (все) и генов с гипер-DMR на CGI и энхансеров (Hyper) между тестом (Aged и Aged/Y HSCs HSC) и контролем (Молодые HSC). Средние и медианные значения обозначены красными точками и горизонтальными полосами соответственно. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Данные второй когорты представлены на рис. S3. *, P <0,05; ***, P <0,001; ns, не являются значительными по тесту Стьюдента.

Материалы и методы

Мыши 8-недельных мышей C57BL / 6 (B6-CD45.2) были приобретены в Japan SLC и разводились в течение 16–19 мес. В экспериментальных помещениях на животных Университета Чиба и Института медицинских наук Университета Токио. . Мыши C57BL / 6, конгенные по локусу Ly5 (B6-CD45.1), были приобретены в Sankyo-Lab Service. В настоящем исследовании использовались только самки мышей. Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с нашими институциональными руководящими принципами по использованию лабораторных животных и одобрены Наблюдательным советом по экспериментам на животных Университета Чиба (идентификатор утверждения 30–56) и Институтом медицинских наук Токийского университета (разрешение ID ПС18-02)

Проточная цитометрия и антитела

Клетки ВМ были выделены путем дробления костей таза, бедренной кости и голени. Проточные цитометрические анализы и сортировку клеток проводили с использованием моноклональных антител, распознающих следующие антигены: CD45.2 (10в4), CD45.1 (A20), Gr-1 (RB6-8C5), CD11b / Mac-1 (M1 / 70), Ter- 119 (TER-119), CD127 / IL7Rα (SB / 199), CD4 (GK1.5), CD8α (53–6,7), B220 (RA3-6B2), CD117 / c-Kit (2B8), Sca-1 ( D7), CD135 / Flk2 (A2F10), CD34 (RAM34), CD150 (TC15-12F12.2) и CD48 (HM48-1). Эти антитела были приобретены у BD Biosciences, eBioscience, BioLegend, TOMBO и R&D Systems. Мертвые клетки удаляли окрашиванием йодидом пропидия 0,5 мкг / мл (Sigma-Aldrich). Все анализы проточной цитометрии и сортировка клеток выполнялись на FACS Aria III, FACS Canto II или FACS Celesta (BD Biosciences).

Трансплантация BM без предварительной подготовки

Что касается трансплантации BM без предварительной обработки, очищенные клетки LSK от 20-месячных мышей CD45.2 в возрасте и c-Kit + HSPC от 12-месячных или 8-недельных мышей CD45.2 трансплантировали путем инъекции в хвостовую вену некондиционированных мышей-реципиентов CD45.1 в возрасте 8 недель. Клетки c-Kit + обогащали с использованием CD117 / c-Kit (2B8) –APCantibody (BioLegend) и анти-APC MicroBeads (MACS MiltenyiBiotec), а затем клетки LSK сортировали на FACS Aria III. Количество HSC в трансплантированных клетках LSK или c-Kit + рассчитывали по пропорциям HSC в тестируемых клетках. При функциональной оценке трансплантированных HSC без предварительного кондиционирования LSK-клетки или HSC очищали из позвоночника, таза, бедренной кости и голени через 2 месяца после трансплантации, а затем трансплантировали смертельно облученным (9,5 Гр) мышам CD45.1 свежеприготовленные 2 × 105CD45 .2 клетки-конкуренты BM.

Секвенирование РНК

3000 HSC были выделены от мышей-первичных реципиентов (CD45.2 + Aged / Y HSC и CD45.1 + Young HSC) и 20-месячных мышей CD45.2 + (Aged HSC). РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) и подвергали обратной транскрипции и амплификации с помощью набора SMARTer Ultra Low Input RNA для секвенирования (Clontech). После обработки ультразвуком с помощью ультразвукового прибора (Covaris) библиотеки для секвенирования РНК были созданы из фрагментированной ДНК с восемью циклами амплификации с использованием набора NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit (New England Biolabs). После количественной оценки библиотек с помощью Bioanalyzer (Agilent) образцы подвергали секвенированию с помощью Hiseq1500 (Illumina) и проводили 61 цикл реакции секвенирования. TopHat2 (версия 2.0.13; с параметрами по умолчанию) и Bowtie2 (версия 2.1.0) использовались для выравнивания с эталонным геномом мыши (mm10 от Калифорнийского университета, Santa Cruz Genome Browser). Нормализация и удаление пакетных эффектов значения подсчета и значительных различий в выражениях были обнаружены с помощью DESeq2 (версия 2.2.1; Love et al., 2014), первичные значения созданы с помощью StringTie. Нормализованное количество было преобразовано в log2 и масштабировано по Z-значениям перед выполнением анализа ПК и анализа тепловой карты, за исключением иерархической кластеризации. GSEA проводился по генам, связанным со старением (Wahlestedt et al., 2013). Анализ путей биологических процессов GO, молекулярных механизмов GO, пути KEGG, пути Wiki и пути Reactome, связанных с генами-кандидатами, проводился с использованием g: Profiler инструмент с P <0,05.

WGBS

Геномную ДНК экстрагировали из 7500 очищенных HSC с использованием набора aDNeasy Blood & Tissue (Qiagen). Подготовка библиотек секвенирования для WGBS в основном выполнялась с использованием протокола маркировки адаптера бисульфита (tPBAT), как описано ранее (Miura et al., 2019,2012). Чтобы контролировать эффективность превращения бисульфита, неметилированную лямбда-ДНК (Promega) добавляли к каждой ДНК в количестве 1%. Концентрацию библиотек для секвенирования оценивали с помощью набора для количественного определения библиотеки от Takara Bio. Библиотеки tPBAT смешивали с контрольной библиотекой PhiX (Illumina) в молярном соотношении 80:20, и общую концентрацию смешанной библиотеки доводили до 600 пМ. Библиотеки были отправлены в Macrogen Japan, и секвенирование было выполнено с использованием HiSeq X с режимом парных концов (2 × 150 циклов). Данные последовательностей, демультиплексированные Macro-gen Japan, использовали для последующего анализа. Считывания были сопоставлены с эталонным геномом, который состоит из генома мыши (mm10) и фага энтеробактерий лямбда (GenBank, номер доступа J02459.1) с использованием BMap, программы картирования бисульфитов, как описано ранее (Miura et al., 2019). С помощью ряда внутренних программ были подведены итоги согласований. Результаты базового статистического анализа данных метилома показаны в таблице S3 A. Данные WGBS были сопоставлены с геномом мыши (мм10) с использованием программного обеспечения Bismark (Институт Бабрахама). Баллы метилирования рассчитывались как количество неконвертированных считываний, разделенное на количество общих считываний в каждом CGI (университет Калифорнии в мм10, Santa Cruz Genome Browser) и энхансерной области, активной в долгосрочных HSC, определенных ранее (Lara-Astiaso et al. 2014). DMR, которые показали значительную разницу в уровнях метилирования (q <0,05) и разницу в метилировании ≥ 5,0%, были идентифицированы с помощью methylKit (BioMed Central). AnnotatePeaks использовался в дополнение к связыванию пиков с соседними генами.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием Graph Pad Prismversion 8. Непарный двусторонний t-тест или однофакторный дисперсионный анализ ANOVA выполняли, как показано на рисунках. В скрипичных диаграммах прямоугольники обозначают диапазоны 25–75-го процентиля. Вертикальные линии представляют диапазоны 10–90-го процентиля. Красные точки и горизонтальные полосы указывают среднее и медианное значения соответственно. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) или стандартное отклонение, как указано. Достоверность принималась при значениях *, P <0,05; **, P <0,01; и ***, P <0,001.

Номера доступа

Данные РНК-секвенирования и WGBS были депонированы в Банке данных ДНК Японии под номером доступа. DRA010901.

Дополнительные материалы

На рис. S1 представлены данные длительного кроветворения с помощью старых HSC, приживленных в некондиционированной молодой нише. S2 показывает профиль транскриптома старых HSC (когорта 3). S3 показывает сравнение метилирования ДНК между Young, Aged, и Ag-ed/Y HSC. В таблице S1 показаны DEG между молодыми и пожилыми HSC. В таблице S2, A и B показаны данные GSEA для старых HSC и сводка анализа путей пяти кластерных генов. В таблице S3, A и B показаны основные статистические данные по метиломам и DMR в старых HSC.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Тацуки Сугияму и Такаши Нагасаву за технические советы; Ацунори Сарая, Макико Юи и Хироко Цукуи за их любезную помощь; и Микако Курибаяси за графические иллюстрации. Ресурсы для суперкомпьютеров были предоставлены Центром генома человека Института медицинских наук Токийского университета при частичной поддержке Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий в рамках грантов на научные исследования (JP19H05653) , Научные исследования в инновационных областях «Старение и болезнь стволовых клеток» (JP26115002) и «Репликация негеномных кодов» (JP19H05746), а также Проект платформы Японского агентства медицинских исследований и разработок для поддержки открытия лекарств и исследований в области наук о жизни (основа за поддержку открытия инновационных лекарств и исследований в области наук о жизни) в рамках гранта JP20am0101103 (номер поддержки 1803). Вклад авторов: В. Курибаяси провел эксперименты, проанализировал результаты, сделал рисунки и активно написал рукопись; М. Осима, Н. Итокава, С. Койде, Ю. Накадзима-Такаги, С. Ямазаки, М. Ямасита, Б. Рахмутулла, Ф. Миура и Т. Ито помогали в проведении экспериментов; М. Ямасита редактировал рукопись; А. Канеда концептуализировал исследование и отредактировал рукопись; А. Ивама задумал и руководил проектом, обеспечил финансирование и активно написал рукопись.

Авторы

Wakako Kuribayashi 1,2, Motohiko Oshima 2, NaokiItokawa 1,2, Shuhei Koide 2, Yaeko Nakajima-Takagi 2, Masayuki Yamashita 2, Satoshi Yamazaki 3,4, Bahityar Rahmutulla 5, FumihitoMiura 6, Takashi Ito 6, Atsushi Kaneda 5, and Atsushi Iwama 1,2

Раскрытие информации

авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Поступило: 4 декабря 2019 г.

Доработана: 17 сентября 2020 г.

Принята в печать: 19 октября 2020 г.

Оригинальная статья (PDF): Limited rejuvenation of aged hematopoietic stem cells in young bone marrow niche

Перевод Ник Сестрин

Пора кончать со старой кровью - Джош Миттельдорф

kartinka

2020 год обещает нам, что мы сможем сделать наши тела молодыми без явного восстановления молекулярных повреждений, но лишь просто изменив сигнальную среду.

Нужно ли добавлять сигналы «молодости» или удалять сигналы «старости»? Влияет ли инфузия биохимических сигналов молодой плазмы крови на ткани старого животного? Или у старых животных есть растворенные сигнальные белки, которые необходимо удалить?

Уже десять лет Ирена и Майк Конбой говорят нам, что удаление плохих акторов является более важным. Но только в прошлом месяце Гарольд Катчер сообщил о впечатляющих успехах при инфузии плазменной фракции, ничего при этом не забирая. Затем, на прошлой неделе, Конбои вновь продемонстрировали омолаживающую силу простого разбавления.

Вот ссылка на перевод их исследования:
Омоложение тканей трех зародышевых листков путем замены плазмы старой крови солевым раствором альбумина

Процедура разбавления

Они просто заменили половину плазмы крови у двухлетних мышей физиологическим раствором, содержащим 5% альбумина. Что такое альбумин? Плазма крови полна растворенных белков, составляющих около 10% её веса. Примерно половина из них это альбумин. Альбумин неизменно присутствует в крови. Всю жизнь. Сам по себе он не несет информации. Но альбумин транспортирует питательные вещества и минералы по всему организму.

Конбои позаботились о том, чтобы показать, что альбумин сам по себе не обладает омолаживающей способностью и не имеет ничего общего с их экспериментальными результатами. Скорее, разбавляя кровь, они должны были пополнять альбумин, потому что животным стало бы плохо, если бы половина их альбумина была удалена. Замена альбумина при переливании крови сродни замене объема воды или поддержанию солености.

Готовясь к этому эксперименту, Конбои потратили годы на миниатюризацию технологии переливания крови, чтобы мышей можно было подвергать тем же процедурам, которые обычны в больницах для людей.

Доза-Ответ

Лаборатория Конбой заменила 50% плазмы крови мыши. Они получили впечатляющие результаты за единственную процедуру, благодаря счастливой догадке. Они еще не экспериментировали с 30% или 70%. Они еще не знают, как долго продлится эффект лечения и как часто его нужно повторять.

Свидетельство омоложения

Как и в предыдущих работах из лаборатории Конбой, группа сосредоточилась на восстановительной способности и активности стволовых клеток как свидетельстве более молодого состояния. Три отдельных образца ткани были взяты из печени, мышц и мозга.

«Восстановление мышц улучшилось, фиброз был ослаблен, а подавление миогенной пролиферации было переключено на усиление; адипозность печени и фиброз уменьшились; и нейрогенез гиппокампа был увеличен».

Они измерили факторы роста нервной ткани в головном мозге и обнаружили более сильный ответ, типичный для молодых мышей.
Они рассекли мышцы и продемонстрировали показатели восстановления, типичные для гораздо более молодых животных
Они исследовали срезы ткани печени под микроскопом и показали, что она менее жирная и с меньшим числом растяжек, чем это характерно для более старых мышей.

Рисунок 2. Омоложение взрослого миогенеза и альбумин-независимые эффекты TPE. Через один день после NBE мышца была повреждена в двух местах на одну TA за счет кардиотоксина; Через 5 дней мышцу изолировали и подвергали криосекции при 10 мкм. (A) Репрезентативные изображения H & E и eMyHC IF места травмы. Шкала бар = 50 мкм. (B) Регенеративный индекс: количество центрально-ядерных миофибрилл на общее количество ядер. OO против ONBE p = 0,000001, YY против ONBE, несущественный p = 0,4014; Фиброзный индекс: белый, лишенный областей миофибрилл. OO против ONBE p = 0,000048, YY против YNBE незначимых p = 0,1712. Минимальный диаметр Ферета для миофибрилл eMyHC + нормирован на среднее значение YY [9]. OO против ONBE p = 3,04346E-05, YY против YNBE p = 0,009. Точками данных являются места повреждения ТА у 4-5 животных YNBE и 5 животных ONBE. Уровни «Молодой» и «Старый» (подробно на дополнительном рисунке 1) - пунктирные линии. Репрезентативные изображения для когорт YY против YNBE показаны на дополнительном рис 6. (C) Автоматическая микроскопическая количественная оценка реакции на дозу HSA в виде кратного различия в клетках BrdU + от одного OPTI-MEM (0 HSA). Не было увеличения миогенной пролиферации при 1-16% HSA. N = 6. (D) Мета-экспресс-количественная оценка клеток BrdU + с помощью автоматической высокопроизводительной микроскопии для миобластов, культивируемых с 4% PreTPE по сравнению с сывороткой PostTPE, и (E) для этих клеток, культивируемых с 4% каждого: PreTPE сыворотка + HSA или PostTPE сыворотка + HSA. Значительное увеличение количества BrdU-позитивных клеток выявляется у каждого субъекта 1, 2, 3 и 4 для обработанной TPE сыворотки (р = 0,011, <0,0001, <0,0001, 0,0039 соответственно), а также для обработанной TPE сыворотки, когда 4 % HSA присутствует (р <0,0001, <0,0001, <0,0001, = 0,009 соответственно). N = 6. (F) Диаграмма рассеяния со средними значениями и SEM для всех когорт Pre-TPE, Post-TPE, +/- HSA показывает значительное улучшение пролиферации в Pre-TPE по сравнению с когортами после и после TPE (p * = 0,033), а также Pre + HSA и Post + HSA когорты (p * = 0,0116). Напротив, при сравнении Pre с Pre + HSA (p = 0,744) или Post с Post + HSA значительного изменения не наблюдалось (p = 0,9733). N = 4 субъекта X 6 независимых анализов для каждого в каждом условии. (G) Репрезентативное окрашивание BrdU IF и Hoechst в субрегионах одного из 9 участков, которые были получены с помощью автоматической микроскопии. Сыворотка крови от старых особей уменьшала пролиферацию миогенных клеток с очень небольшим количеством видимых клеток BrdU + (показано одной положительной клеткой в Pre-TPE и стрелкой, указывающей на соответствующее ядро); TPE отменил это ингибирование, но HSA не оказал заметного эффекта.

Чего не хватает? Они не проверяли какие-либо показатели физической или когнитивной работоспособности на организменном уровне.

Свидетельство изменений в поведении (обучение и память, выносливость, сила)
Воспалительные маркеры
Липиды крови
Часы метилирования (Horvath, UCLA) или протеомные часы (Lehallier, Stanford)

Часть этого запланирована для будущих исследований. Майк и Ирина планируют представить образцы ткани для анализа с помощью часов метилирования мыши по Хорвату.

Часы?

Я убежденный энтузиаст метилирования и протеомных часов, которые являются лучшими суррогатными биомаркерами, что у нас есть для оценки старения. Эти технологии могут сказать нам, были ли эффективными антивозрастные вмешательства, не дожидаясь смерти животных (или людей), прежде чем сообщать о результатах. Но Конбои по-прежнему считают эти технологии недоказанными, и они ощетинились при слове «часы». Самое большее, что они здесь сделали, это каталогизировали весь протеом обработанных мышей, сравнивая его с необработанными молодыми и старыми мышами.

Многомерный анализ t-SNE и тепловое картирование этих данных выявили, что протеом ONBE значительно отличался от ОО и восстановил некоторые сходства с протеомом YY. Дополнительный рисунок 4 подтверждает статистическую значимость этой сравнительной протеомики с помощью анализа мощности и показывает тепловую карту YY против OO, где возрастные различия менее выражены, чем различия между OO и ONBE, снова подчеркивая сильное влияние NBE на молекулярный состав системной среды.

Перевожу: в качестве контроля у них были мыши, которым проводили обмен плазмы с мышами аналогичного возраста. YY были молодыми, положительными контролями, а ОО были старыми, отрицательными контролями. Обработанные мыши были ONBE = «Старые мыши - Нейтральный обмен крови( Old—Neutral Blood Exchange)». Вместо того чтобы полагаться на алгоритмы «часов», которые вычисляют возраст по протеому, они сравнили целиком протеомы тестируемых животных с протеомами старых и молодых животными и обнаружили, что они более похожи на молодых животных.

Старение и эпигенетика

Я был ранним сторонником теории, что старение обусловлено прежде всего изменениями в эпигенетике. В число приверженцев этого взгляда также входят Джонсон, Рандо и Хорват. Эта теория в настоящее время является преобладающей, хотя принята далеко не всеми. (Основная причина, по которой людям трудно понять эту идею, заключается в том, что «каким образом саморазрушение тела может быть частью его развития?». Я представляю исчерпывающий ответ в своей популярной книге и моей академической работе.)

На первый взгляд, новый результат Конбоев является убедительным доказательством эпигенетической теории. Они показали, что в крови есть белки, которые активно замедляют рост и заживление. Удалите половину этих белков, и животные смогут вырастить молодые ткани и самовосстанавливаться лучше. Очевидный вывод состоит в том, что с возрастом в крови происходят изменения сигналинга, которые ослабляют животное и препятствуют восстановлению.

Однако есть и другие способы интерпретации. Обри де Грей сказал (из личного общения):

«Когда все в крови, кроме клеток и альбумина, заменяется водой, организм определенно реагирует, синтезируя и секретируя все, в чем обнаруживает недостаток, тогда как всякое плохое не будет заменено так быстро, так как в основном там присутствует в результате нарушения экскреции / деградации ».

Конбои не принимают теорию запрограммированного старения, но их понимание того, что они видят, также не совпадает и с пониманием Обри. Ирина объяснила мне это так: возраст биологического организма - это просто мера того, сколько вреда накоплено, но эпигенетические и каталитические циклы самоподдерживаются.

«Эпигенетика, мРНК и белок - это ступени одного процесса, регуляции экспрессии генов. И ни один из этих этапов не является постоянным, все они активно и постоянно реагируют на клеточную среду-тканевую и системную среду... со старением происходит дрейф, который перекалибруется рядом подходов к омоложению...когда аутоиндуктивный возрастной повышенный лиганд разбавляется, он не может активировать свой собственный рецептор и индуцировать свою собственную мРНК, поэтому уровни лиганда уменьшаются до их более молодых состояний на продолжительное время."

Конбои предполагают, что эти вредные белки являются частью цикла положительной обратной связи, другими словами, цикла, который является самоподдерживающимся

эпигенетическое состояние ⇒ экспрессия генов ⇒ трансляция в циркулирующие белки ⇒ обратная связь, которая изменяет эпигенетическое состояние

С возрастом тело погружается в дисфункциональный, самоподдерживающийся цикл, и его нарушение может подтолкнуть его обратно к более крепкому и молодому циклу, также самоподдерживающемуся.

Рисунок 6. Модель эффекта разведения при сбросе кровеносного протеома. Система: A индуцирует себя (A, красный) и C (синий); A подавляет B (зеленый), C подавляет A. Разведение белка повышенного в связи с возрастом (A, на D1: событие начального разведения), нарушает аутоиндукцию и снижает уровень A (событие 1, красная стрелка); вторичная цель A (B, в событии 2 зеленая стрелка) затем становится дерепрессированной и повышается (B индуцирует B, постулируется); аттенюатор A (C, на событии 3 синяя стрелка) имеет уменьшенную задержку по времени (TD), поскольку он является внутриклеточным и не был немедленно разбавлен, а некоторые уровни белка сохраняются даже после более низкой индукции C при помощи A. C уменьшается (больше не индуцируется A), и перезагрузка A приводит к реиндукции C при помощи A (синяя стрелка события 4), ведущая к вторичному снижению интенсивности сигнализации A / автоиндукции и вторичной восходящей волне B (события 5 красная стрелка и 6 зеленая стрелка соответственно).

Для меня удивительным в рассказе Ирины является то, что в этой системе нет гистерезиса. Перепрограммирование реагирует на изменения уровня сигналов в крови в течение нескольких минут. Для такой системы трудно быть гомеостатической. Интересно, как это может быть. Жизнь - это все о гомеостазе, и все мы интуитивно понимаем, что петли отрицательной обратной связи встречаются чаще, чем петли положительной обратной связи. (Петли отрицательной обратной связи приводят к гомеостазу; петли положительной обратной связи ведут к неконтролируемому, экспоненциальному изменению.)

Есть ли где-то часы? С мозгом это как-то связано?

По мнению Конбоев, сигналы в крови испускаются по всему телу, а не преимущественно из гипоталамуса. Если мозговая ткань реагирует, казалось бы, исключительным образом на белки в крови, это происходит из-за селективного прохождения этих белков через гематоэнцефалический барьер.

Авторы напоминают нам, что в прошлых экспериментах с парабиозом (где кровь обменивалась между старыми и молодыми мышами), мозговая ткань молодых мышей старела, но мозг старых мышей не становился моложе. Это указывало на то, что старение мозга вызвано утверждающими действиями «плохих акторов» в плазме и что они способны проникать через гематоэнцефалический барьер. Это наблюдение отчасти вдохновило на текущие эксперименты.

Соответствующая процедура для людей уже одобрена FDA

Терапевтический плазменный обмен (ТПЭ) является хорошо зарекомендовавшей себя медицинской процедурой, и соавтор Добри Кипров уже проводил ее на экспериментальной основе. Есть история наводящих на разные догадки результатов, о которых я напишу в следующем посте.

Сравнение с Эликсиром Катчера

Объявление на этой неделе от Конбоев и препринт в прошлом месяце от Katcher / Horvath исходят из одного и того же направления мысли: старение координируется по всему телу с помощью сигнальных молекул в крови. Оба продемонстрировали значительное омоложение у грызунов на основе краткосрочного вмешательства, и у обоих есть планы по коммерциализации и как можно скорее начать испытания на людях.

Поэтому любопытно, что в других отношениях программы Катчера и Конбоев настолько различны.

В то время как оба подхода основаны на том, что состав плазмы крови различается между молодыми и старыми, Конбои сосредоточены исключительно на удалении того, что препятствует юношеской регенерации, в то время как подход Катчера заключается в добавлении обратно белков, которые раньше сохраняли животное молодым.
Конбои полностью раскрыли все аспекты своего экспериментального протокола, в то время как содержание эликсира Катчера остается коммерческой тайной.
Катчер находится на обочине академических исследований, а лаборатория Конбоев находится в одном из ведущих академических учреждений в мире.
Катчер на год впереди, экспериментируя с различными дозами и временем. Ни Катчер, ни лаборатория Конбоев еще не продемонстрировали продление жизни.
Конбои демонстрируют омоложение с заживлением ран, структурой ткани и возобновлением роста нервов. Заявление Катчера основано на физиологии (особенно воспалении), когнитивных способностях и алгоритмах метилирования.
Фактически, Катчер рассматривает восстановление юношеских паттернов метилирования как лучшее доказательство, которое можно предъявить в пользу омоложения (я согласен), в то время как Конбои не торопятся судить о важности метилирования и сердятся при упоминании «часов» метилирования.
Катчер понимает эффект переливания плазмы с точки зрения широкой теории (которую я поддерживаю). Старение - это эпигенетическая программа, управляемая и поддерживаемая «часами», которые работают через петлю обратной связи между циркулирующими белками, которые управляют экспрессией генов и экспрессией генов, которые генерируют эти белки. Конбои признают, что работают с этой петлей обратной связи (их рис. 6), но они сопротивляются теории, что это является основной причиной старения.

Я предполагаю, что комбинация их двух подходов будет необходима для полного устранения старения, и что комбинация их ресурсов, авторитета, теоретических оснований и контактов станет преобразующим событием для медицинской науки, для биотехнологической промышленности и для биологической теории. Я искренне надеюсь, что Катчер и Конбои смогут работать вместе.

Источник

joshmitteldorf.scienceblog.com

Перевод

Ник Сестрин

НОВОСТИ ПО ТЕМЕ:

Prev Next

Разведение плазмы улучшает когнитивные функции и снижает нейровоспаление у старых мышей

Наше недавнее исследование установило, что факторы молодой крови не являются причиной и не являются необходимостью для системного омоложения тканей млекопитающих...

	Effects on the brain
TPE elevated
BDNF	Neurogenesis, neuroprotection, plasticity related to learning and memory [53]
Tomoregulin1	Neuroprotection: binds amyloid-β (Aβ) [54]
VEGF	Neuroprotection, secreted by neurons [55]
MMP-2, 7, 8, 9	Synaptic re-organization and memory [56]
Siglec	Neuroprotection; alleviates microglial toxicity [57, 58]
GRO-a	Oligodendrocyte proliferation and migration [59]
HB-EGF	Neuroprotection and function [60]
Angiogenin	Neuroprotection [61]
Robo4	Neurogenesis [62]
OSM	Neuroprotection and homeostasis of neural precursor cells [63]
Neurturin	Neuroprotection and neurogenesis [64]
Endothelin	Functional activity: neurotransmission [65]
NBE elevated
Platelet factor 4	Neurogenesis [66]
Erythropoietin	Neuroprotection [67]
Fractalkine	Homeostasis: neuron/glia crosstalk [68]
TNF-β	Neuronal plasticity, synaptic scaling, hippocampal neurogenesis [69]
TIMP-2	Inhibits neuronal proliferation and promotes the differentiation [70]
Betacellulin	Neurogenesis [71, 72]
GDF5	Neurogenesis and neuroprotection [73, 74].
Osteoactivin	Neuroprotection: expressed on microglia—phagocytosis of myelin debris [75]
IGF-BP2	Neuronal plasticity, learning, and memory as well as information processing [76, 77]
uPA	Neuroprotection and repair [78, 79]
AgRP	Functional activity [80, 81]

Универсальный возраст по метилированию ДНК в тканях млекопитающих (препринт)

Новые результаты

Введение

Мета-анализ возраст-связанных CpG в определенных тканях

Анализ функционального обогащения возраст-связанных CpG

Частичное пересечение возраст-связанных цитозинов с человеческими особенностями и заболеваниями

Разработка универсальных пан-тканевых эпигенетических часов возраста для млекопитающих

Характеристики универсальных эпигенетических часов для разных видов

Оценка эффективности универсальных эпигенетических часов в тканях

Обсуждение

МЕТОДЫ

Образцы тканей

Контроль качества универсальных часов

Характеристики видов

Мета-анализ изучения эпигенетической зависимости (EWAS) возраста

Мета-анализ для EWAS возраста

Стратификация возрастных групп

EWAS Мозга

EWAS одиночной ткани

GREAT анализ

Анализ перекрытия на основе EWAS-GWAS (Эпигенетические-генетические ассоциации)

Связь экспрессии гена LHFPL с хронологическим возрастом у человека и мыши

Три вида универсальных часов млекопитающих для плацентарных

Преобразование Loglog относительного возраста для часов 2

Преобразование на основе лог-линейного возраста для часов 3

Часы для сумчатых

Эластичная чистая регрессия

Статистика оценки прогностических возможностей модели

URLs

Доступность данных

Вклад авторов

КОНКУРИРУЮЩИЕ ИНТЕРЕСЫ

CORRESPONDING AUTHOR

БЛАГОДАРНОСТИ и ФИНАНСИРОВАНИЕ

Ограниченное омоложение старых гемопоэтических стволовых клеток в молодой нише костного мозга

Введение

Полученные результаты

Характеристики старых HSC, привитых в неповрежденную молодую нишу

Возрастное аберрантное метилирование ДНК устойчиво к омоложению ниши

Материалы и методы

Проточная цитометрия и антитела

Трансплантация BM без предварительной подготовки

Секвенирование РНК

WGBS

Статистический анализ

Номера доступа

Дополнительные материалы

Благодарности

Авторы

Раскрытие информации

Пора кончать со старой кровью - Джош Миттельдорф

Процедура разбавления

Доза-Ответ

Свидетельство омоложения

Часы?

Старение и эпигенетика

Есть ли где-то часы? С мозгом это как-то связано?

Соответствующая процедура для людей уже одобрена FDA

Сравнение с Эликсиром Катчера

НОВОСТИ ПО ТЕМЕ:

Разведение плазмы улучшает когнитивные функции и снижает нейровоспаление у старых мышей

Введение

Полученные результаты

Когнитивные способности старых мышей улучшаются с помощью одной процедуры NBE

Возрастное увеличение нейровоспаления значительно ослабляется NBE

ABT 263 сенолитик и NBE оба уменьшают старение мозга, но ABT 263 не может усилить нейрогенез или значительно уменьшить нейровоспаление у старых мышей

Эволюционно консервативные эффекты NBE и TPE на системные белки с прямым влиянием на мозг

Обсуждение

Материалы и методы

Животные

Количество животных (N)

Операция по канюлированию яремной вены и процедуры обмена крови

ABT-263 лечение

Кардиотоксиновая травма мышц

Тканевая изоляция

Разделение тканей и картирование мозга

Окрашивание β-галактозидазой, ассоциированное со старением

Антитела и реагенты для маркировки

Иммунофлуоресценция образцов мозга

Поведенческие анализы